帕金森病的非人靈長類動物模型研究進展

宋凈洋 車祥源 邢紅霞

1.新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，河南衛輝 453100；2.新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科，河南新鄉 453000

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中常見的神經退行性疾病［1］，以中腦黑質多巴胺（dopamine，DA）能神經元退行性變性死亡以及路易小體的形成為主要病理生理特征。PD 的發病機制目前尚未闡明，可能與環境、遺傳、線粒體功能障礙、氧化應激、免疫異常、細胞凋亡等諸多因素有關。目前PD的治療主要以改善癥狀的藥物治療為主，但仍然缺乏有效的根治措施，到了疾病晚期階段，患者往往生活難以自理，因此給PD 患者其所在的家庭及社會都帶來沉重的負擔。要進行PD 疾病的研究，通常需要構建理想的PD 動物模型。嚙齒類動物與人的差異較大，而非人靈長類（non-human primates，NHPs）的行為能力和神經解剖學復雜性非常類似于人類，因此NHPs的使用無疑是研究PD 的關鍵工具。因此筆者主要針對PD 的NHPs 動物模型做一介紹。

1 現有PD 動物模型

PD 的研究過程中有兩個主要困難：一是缺乏完整的參與神經退行性過程的分子機制，二是缺乏擁有充分的可進行方法評估的預測模型。第一個困難可以通過在眾多類型PD 動物模型中研究得出。而第二個困難目前尚未解決。目前通過基因改造和神經毒素的干預產生的PD 動物模型并沒有產生在行為和病理結果上均可預測的PD 動物模型。

最近，通過將外源基因引入NHPs 基因組或改變NHPs 的內源基因，產生了幾種NHPs 轉基因動物模型［2］。雖然NHPs 轉基因動物模型有助于了解PD 的發病機制，但是由于NHPs 與嚙齒類動物比較壽命長，因此對NHPs 的PD 模型發病機制的研究需要很長的時間。而當前可用的遺傳模型也不能完全誘導出具有明顯神經退行性變的PD 表型［3］，神經毒性模型則可以通過破壞黑質紋狀體通路誘導出具有明顯神經退行性變的PD 表型［4］。NHPs 動物模型是一種公認的PD 模型，現在研究大多通過使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）和6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導黑質紋狀體神經元選擇性變性誘導PD 模型［5］，這些模型可以通過神經毒素的全身或局部給藥來發揮作用［6］。

2 NHPs 中經典PD 動物模型

2.1 NHPs 中MPTP 誘導PD 動物模型

MPTP 是高度親脂性化合物，它可以快速穿過血腦屏障。MPTP 毒性的潛在機制是單胺氧化酶B 將MPTP 轉化為陽離子MPP+，該陽離子可通過黑質致密部進入DA 能神經元。MPP+主要通過阻斷線粒體復合體Ⅰ的活性導致ATP 消耗和氧化應激增加［7］，從而誘導PD 模型。但采用MPTP 誘導的急性神經毒性模型無法復制出與PD 路易小體相似的的蛋白質聚集體，即使長期、大劑量的MPTP 誘導的靈長類PD 動物模型也無法復制出α-突觸核蛋白聚集的病理現象［8-9］。

與其他可用的PD 模型比較，MPTP 模型不需要熟練的立體定位技術，其在生化、解剖學和行為學方面與人類PD 癥狀具有較大的相似性。但與6-OHDA模型比較，在首次注射MPTP 后的24 h 內MPTP 模型可出現因為心臟毒性而引起的劑量依賴性死亡［10］。此外，盡管MPTP 本身并不直接有害，但其代謝產物MPP+具有劇毒，所以采用MPTP 處理動物模型時對處理動物的人員有嚴重的安全隱患［11］，所以需要具有嚴格安全設備的實驗室。

2.2 NHPs 中6-OHDA 誘導PD 動物模型

6-OHDA 是一種兒茶酚胺能神經毒素，廣泛用于誘導嚙齒動物和NHPs 動物中DA 能神經元的死亡［12］。6-OHDA 不能透過血腦屏障，所以需要將6-OHDA立體定位直接注入到目標大腦區域。兒茶酚胺能神經元可以通過單胺轉運蛋白選擇性吸收6-OHDA，通過增加活性氧的產生誘導交感神經元的丟失，破壞能量代謝和神經元的活動從而誘導PD 模型［13］。

在NHPs 動物中，將6-OHDA 注入到黑質紋狀體束或紋狀體內會導致典型的帕金森樣運動缺陷，這與黑質區酪氨酸羥化酶（TH）陽性細胞的丟失有關。除了將6-OHDA 立體定位直接注入到目標大腦區域外，也可以全身給藥以模擬心臟自主神經功能失調狀態［14］。靜脈注射6-OHDA 會引起心臟兒茶酚胺能神經支配的喪失和循環兒茶酚胺水平的降低［15］，但在6-OHDA 模型中仍然沒有觀察到路易小體或α-突觸核蛋白的聚集體。

3 NHPs 中新型PD 動物模型

經典的PD 動物模型（6-OHDA 和MPTP 模型）雖然能夠模擬人類PD 的病理生化改變，但不能模擬PD 主要的病理生理特征，即細胞內路易小體的形成。而α-突觸核蛋白是形成路易小體的重要成分，其主要由清理毒性蛋白的泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin proteasome system，UPS）降解［16］。因此McNaught 等［17］構建出一種基于抑制UPS 的PD 模型：經PSI 系統（可逆性合成小肽的蛋白酶抑制因子）處理的大鼠在飼養中出現以下癥狀：活動減少、僵直、姿勢異常、震顫等的帕金森綜合征表現，并出現了與PD 相同的神經病理學特征：黑質中TH 陽性DA 神經元細胞的丟失，紋狀體DA 耗竭，α-突觸核蛋白和泛素在藍斑、迷走神經背核等的聚集積累。PSI 誘導出的模型和現有使用UPS 抑制劑乳胞素［18］實驗結果相一致。許多研究者使用UPS 抑制劑對嚙齒類動物和靈長類進行全身系統的注射［19］，卻沒有復制出PD 模型［20］，該系統模型構建的失敗可能與一系列因素，如藥物劑量、吸收的因素、藥物暴露時間、通過血腦屏障的通道、所用溶劑等相關。然而，在黑質紋狀體內直接注射UPS 抑制劑產生的初步效果與Lillethorup 等［21］描述的相一致。注射乳胞素到魚的腦脊液中構建的模型，也出現蛋白聚集體、DA 神經元的丟失等病理特征［22］。研究者在嚙齒類動物中的研究顯示TH 陽性的神經元細胞的丟失數量表現出乳胞素-劑量依賴性。這提示，利用腦內UPS 抑制體系的作用可以構建一個與之一致并可重復的模型［23］。

利用UPS 抑制劑建立的模型能夠完整地展現出：PD 的運動和非運動臨床特征，TH 陽性神經元細胞的丟失，黑質區炎癥標志物的增多，內含α-突觸核蛋白和泛素的包涵體的聚集積累等病理特點。因此構建出蛋白酶體功能障礙的NHPs 模型將對探究出PD的發病機制、疾病防治、臨床藥物有效性和安全性評價具有獨特的優勢。

4 NHPs 中PD 動物模型評估

4.1 行為學觀察

為了更好地研究PD，需要建立可以高度復制的PD 動物模型，以解決包括大腦病理變化在內的所有與PD 相關的問題。首先，可以使用臨床評分量表記錄典型的PD 癥狀（如正常、肌肉僵硬等）及異常的非自主運動癥狀（如面部及全身行為等）。這些臨床評分可以通過雙盲方式觀看動物的事后視頻記錄，記錄患病動物的自發運動能力來進行。

4.2 正電子發射斷層掃描（PET）

PET 成像是一種相對非侵入性的神經成像技術，可用于闡明與PD 相關的功能改變，并通過評價黑質紋狀體DA 系統的完整性來提供診斷信息［24-26］。在異氟醚麻醉下，NHPs 可進行PET 掃描，使用包括18FDOPA、18F-FP-CIT、11C-FP-CIT、11C-CFT、11C-PE2I、18F-AV-133、11C-DTBZ 等在內的正電子發射同位素標記的示蹤化合物，可以對體內的生化過程進行成像和測量［27-28］。

4.3 磁共振成像（MRI）

功能性和結構性腦成像的快速發展使得觀察腦功能的特定變化成為可能。MRI 比PET 應用廣泛得多，是在體內對整個大腦進行解剖成像最常用的系統。它可以非侵入性獲取PD 引起病變的功能性圖像［29］。NHPs 是進行PD 研究的最合適的物種，目前已越來越多地通過MRI 進行研究。MR 光譜也可以用作非侵入性工具，通過測量某些代謝物的存在和濃度來評估與神經變性和抗PD 治療相關的體內動態變化［30］。

4.4 病理學檢測

雖然對黑質紋狀體系統的評價是PD 研究的基本工具，但病理學檢測也很重要。我們建議在戊巴比妥深度麻醉下，行心內灌注肝素化鹽水，然后取出大腦，固定后進行形態學處理。猴腦的大小（與大鼠或小鼠比較）具有以下優點：新鮮器官可以切片，確定區域，并且可以采集特定目標區域的小組織樣本。也可以通過電化學檢測功能的高效液相色譜法（HPLC）檢測新鮮腦樣本、腦脊液或通過體內微透析獲得細胞外液中的DA 和DA 代謝產物3，4-二羥苯酰乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的量［31］。此外，還可以通過免疫組織化學方法來測定黑質DA 能神經元的數目。

5 結論

盡管動物模型可能無法充分反映人類疾病的特征，但它們可用于分析疾病的某些方面，而使用簡單的體外模型無法對其進行全面研究。人們對NHPs 動物模型的興趣逐漸增加，因為它們是唯一在臨床試驗前進行臨床前評估時與人類具有高度相似性的相關物種。所以，在臨床前階段，將NHPs 用作實驗模型具有許多顯著的優勢。本文通過對PD 的NHPs 動物模型的介紹，可以幫助研究人員根據研究的特定目的選擇合適的造模方法。在PD 的NHPs 動物模型中進行的研究可能有助于開發用于早期診斷的工具，還有可能幫助開發旨在阻止或減慢疾病進展的下一代PD藥物。