外泌體在骨重建以及骨質疏松中的研究進展

陳逸青章秋代芳

安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌科，安徽 合肥 230022

外泌體(exosomes)是一種由多種細胞分泌的、直徑為30～100 nm、大小均一的脂質雙分子層膜衍生囊泡。外泌體內包含mRNA、miRNA、多種類型的蛋白質，參與了腫瘤細胞生長、細胞間通訊和血管再建等重要生理過程。近期很多研究發現外泌體可以通過信號蛋白、miRNA等方式調控骨吸收和骨生成的動態平衡，從而在骨代謝疾病例如骨質疏松癥的發生、發展中起到重要的作用，并可能成為臨床上潛在的生物標志物、藥物遞送以及基因治療的載體[1-2]。本文將就骨細胞分泌的外泌體在骨重建和骨質疏松中的研究進展進行綜述。

1 外泌體的生物學特性

1.1 外泌體的結構與組成

多種細胞均可以分泌外泌體，如各種干細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、血小板、精子、心肌細胞等。在大多數體液中，可檢測到外泌體，如外周血、尿液、唾液、乳汁等[3]。最新的研究[4]發現骨相關的細胞包括破骨細胞的前體細胞、破骨細胞、骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)、成骨細胞、骨細胞也分泌外泌體。

外泌體具有脂質雙層膜，其脂質雙分子層結構中含有豐富的鞘磷脂、膽固醇、神經酰胺及脂筏結構域等，可防止外泌體內部的RNA、蛋白質等生物活性物質在細胞外環境中被破壞。

外泌體內含有多種蛋白質。其中，肌動蛋白、微管蛋白等細胞骨架成分在外泌體內部和表面分布較多，參與了外泌體的結構形成。外泌體除了含有一些四跨膜區蛋白質超家族成員、信號分子等，還同時含有大量與其組織和細胞來源相關的特異蛋白，其蛋白成分依來源細胞的不同而存在差異，這些蛋白可反映出細胞來源的組織/細胞類型。此外，外泌體內還含有較多的miRNA。miRNA為短鏈非編碼RNA，參與轉錄調控多種靶基因的過程。目前，miRNA已成為基礎與臨床科學家的研究熱點，且已有不少研究提示miRNA可作為治療靶點和生物標志物[5-6]。

1.2 外泌體的形成過程

外泌體的形成主要通過細胞內吞作用，包括3個步驟：第一步，細胞膜內陷形成細胞內小泡，此為早期；第二步，晚期內體中的微粒體膜再次內陷形成多泡小體；第三步，多泡小體與細胞膜特定部位融合，囊泡中的內容物釋放，即為外泌體。外泌體的大小取決于其來源的細胞類型及其脂質雙層膜的結構。

1.3 骨起源的外泌體的特點

骨細胞相關的外泌體內的成分與其他來源的外泌體存在差異。在骨重建的微環境中，骨起源的外泌體包含一些特殊的成骨蛋白，如骨形成蛋白1-7(bone morphogenetic protein 1-7，BMP 1-7)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)以及真核起始因子2和非膠原基質蛋白如骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨粘素(osteonectin，ON)等[7]。骨細胞相關的外泌體也包含破骨細胞分化相關蛋白如核因子κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)以及核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB，RANK)[4,8]。骨起源的外泌體還有一些骨重建相關的miRNA，如miR-24、let-7、miR-143-3p、miR-10b-5p、miR-199b、miR-218、miR-214-3p[9-10]。這些miRNA在成骨以及破骨細胞的分化中起到重要的作用。骨相關外泌體內的miRNA的數量和分布與其他細胞的外泌體內的miRNA的數量和分布是不一致的，表明miRNA選擇性地被運輸至骨相關的外泌體并運輸了特異的信息[11]。另外，骨相關的外泌體內還有特異的mRNA，如調節轉錄的BDP1、TAF7L、SOX11和具有激酶活性的LPAR1及ZEB2等[12]。

生理改變以及化學物質可以影響骨重建過程中外泌體的釋放頻率和內容。早期的原始BMSCs較晚期釋放外泌體較少[11]。另外，外泌體的miRNA種類在成骨誘導時與非成骨誘導時也是不同的[13]。年齡也可以影響外泌體的miRNA譜。年輕小鼠骨髓組織液分離出的miR-183簇(miR-96/-182/-183)明顯高于其他年齡段的小鼠[14]。另外，外泌體釋放的頻率也與病理情況有關，比如炎癥、缺氧和pH的變化[15-16]。一些分子，如1α、25-(OH)2D3以及丙咪嗪也可以調節外泌體的產生以及成熟[17-18]。

2 外泌體在骨重建中的作用

骨重建是指去除局部舊的和老的骨代之以新骨的過程，起到防止骨骼老化、增加骨密度的作用。骨重建持續終身，是成熟骨組織的一種替換機制，不僅可預防骨組織疲勞損傷的積累，還保持了骨生物力學功能，并有助于礦物質的穩定。該過程極為復雜，需一系列的細胞過程參與，如破骨細胞、成骨細胞以及BMSCs。同時還需要諸多細胞以及分子因子參與。其中，外泌體在骨吸收以及骨形成方面起到重要作用。只有骨吸收和骨形成動態平衡，才能保持骨的健康。

2.1 外泌體與破骨細胞

破骨細胞是骨吸收的主要功能細胞，是由破骨細胞前體在各種化學因子、轉錄因子和細胞因子等信號因子的刺激下發育成熟而來。在骨吸收的過程中，活躍的破骨細胞將會分泌酸性物質和酶，對礦化的骨基質進行分解吸收，使得該區域的骨量發生下降。

Huynh等[8]最近報道了破骨細胞前體的外泌體有刺激破骨細胞成熟化的作用。然而通過對成熟的破骨細胞培養，卻發現其分泌的外泌體抑制了破骨細胞生成。RANK水平在成熟破骨細胞的外泌體中十分豐富，然而在損耗了這些外泌體里富含的RANK后，發現外泌體介導的抑制破骨細胞形成作用減弱。因此表明外泌體通過表達RANK與破骨細胞表面的RANKL結合，從而競爭性的抑制破骨細胞的RANK通路的激活，也就是說，破骨細胞起源的外泌體是破骨細胞旁分泌的重要調節因子。最新的一些研究發現破骨細胞外泌體內的miRNA也參與了骨重建的過程。破骨細胞起源的miRNA是一組有破骨細胞釋放的可以抑制成骨細胞分化的偶聯因子。miR-214-3p被發現在骨折的老年婦女以及去卵巢小鼠中顯著增加，表明了miR-214-3p可能與骨形成減少有關[9]。Wang等[19]也發現血清miR-214水平增加與老年骨折病人骨切片的骨形成減少有關。同時，注射化學合成的寡核苷酸拮抗miR-214-3p可以改善小鼠低骨量[1,9]。Sun等[1]通過共培養實驗發現破骨細胞中miR-214水平的提高以及其抑制成骨細胞活性的功能是通過膜上EphrinA2/EphA2相互作用來實現的。同時，miR-214也可以通過與成骨細胞的ATF4結合以抑制骨形成[19]。Zhao等[20]通過研究骨髓巨噬細胞還發現miR-214促進破骨細胞的形成還可以通過PI3K/Akt通路。以上研究均表明了存在于破骨細胞外泌體的miR-214通過多種通路的相互作用而促進了骨吸收，影響了骨形成。也有其他研究發現破骨細胞以及其前體的外泌體可以刺激BMSCs的成骨分化[21-22]。綜上所述，破骨細胞介導的外泌體的作用可能是雙向的，其中的分子機制對骨重建的影響尚未明確，尚需進一步探究。

2.2 外泌體與成骨細胞

成骨細胞主要由內外骨膜和骨髓中基質內的BMSC分化而來，是骨形成的主要功能細胞，能特異性分泌多種生物活性物質，調節并影響骨的形成和重建過程。與破骨細胞一樣，成骨細胞也由成骨細胞前體發育成熟而來，并移行至骨吸收陷窩，分泌骨基質，骨基質礦化進而形成新骨。Deng等[4]發現UAMS-32P細胞系(一種成骨細胞系)分泌的外泌體含有RANKL蛋白，可以通過與細胞表面的RANKL結合促進破骨細胞前體的RANK信號通路，導致了破骨細胞的形成。同樣，Solberg等[23-24]發現溶酶體膜蛋白-1(lysosomal membrane protein-1，LAMP-1)陽性的成骨細胞外泌體攜帶了RANKL、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)以及抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，從而可以提高破骨細胞形成。另外，成骨細胞的外泌體還可以通過加強成骨細胞的分化和礦化促進骨重建過程[25]。Cui等[24]發現礦化的成骨細胞形成的外泌體miRNA促進了成骨的分化，其機制可能是通過上調Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)和堿性磷酸酶來促進骨形成。還有研究發現了多種信號通路可以介導骨形成。成骨細胞起源的外泌體里的miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p、miR-335-3p、miR-378b、miR-677-3p以及miR-378表達是明顯升高的，它們是通過Wnt信號通路、胰島素信號通路、TGF-b信號通路以及鈣信號通路等來促進成骨細胞分化和發揮功能[24,26]。綜上，成骨細胞的分化形成受到了多種因素、多種信號通路以及miRNA的調控，成骨細胞分泌的外泌體可以促進或者抑制成骨細胞的分化。

2.3 外泌體與骨髓間充質干細胞

骨髓間充質干細胞是骨髓基質干細胞，它是一種具有分化形成骨、軟骨、脂肪、神經及成肌細胞的多種分化潛能的細胞亞群。很多研究表明，BMSCs有多種功能如促進組織修復[27]、神經保護[28]及多向分化潛能[29]等，其作用方式尚不清楚，在近期的一些研究[30]中發現外泌體可能是其中一種作用機制。

Xu等[13]2014年第一次對在BMSCs成骨過程中的外泌體內的miRNA表達譜進行研究之后發現，let-7a、miR-199b、miR-218、miR-148a、miR-135b、miR-203、miR-219、miR-299-5p 以及miR-302b等九種miRNA在BMSCs起源的外泌體中的表達是明顯升高的。其中，let-7a被發現是通過調節HMGA2基因表達來抑制脂肪形成從而促進骨形成[31]。miR-218是通過Wnt/β-catenin信號通路來促進人脂肪來源的干細胞進行成骨分化[32]。同時，Xu等也發現miR-221、miR-155、miR- 885-5p、miR-181a以及miR-320c在BMSCs起源的外泌體中的表達是下調的。其中，miR-221的下調可以起到促進人非限制成體干細胞的成骨分化[13]。miR- 885-5p、miR-181a可以分別通過靶向Runx2、以及T?R-I/Alk5基因抑制成骨細胞活性以及分化，故其水平下調可以促進成骨細胞的增殖活化[33]。在動物實驗中，有研究者[34]發現，BMSCs起源的外泌體中富含miR-196a，其可以促進顱骨缺損的SD大鼠的骨形成，這項研究也為BMSCs分泌的外泌體在未來骨代謝相關疾病的臨床治療提供了新的思路和方法。

2.4 外泌體與血管化

對于骨骼來說，骨量的增長離不開新生血管的形成以及氧氣和營養的供給。有研究表明血管的新生需要活性可溶性的生長因子如纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以促進血管內皮細胞生長和分化。在對MSCs起源的外泌體的質譜分析后發現，其包含了可溶性的生長因子如VEGF、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta-1，TGFB1)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)，同時大量存在轉錄因子如肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)以通過誘導內皮細胞的增殖和遷移來促進血管生成。同樣地，有研究發現外泌體富含Wnt信號通路的重要效應分子-人T細胞因子4(T-cell factor 4，TCF4)，可以通過外泌體的細胞間信息傳遞促進血管生長。Chen等[35-36]發現MSCs起源的外泌體含有的miRNA如miR210、miR-126、miR-136和miR-21都參與了血管新生，同時含有的miR-6087可以促進內皮細胞分化。在動物實驗中，也有很多研究發現BMSCs起源的外泌體有改善缺血缺氧性損傷的作用。Qi等[37]發現人類多潛能干細胞(human induced pluripotent stem cell，hiPSC)起源的MSCs的外泌體可以通過誘導骨形成和血管再生來促進骨再生，同時發現外泌體可以增強成骨細胞堿性磷酸酶活性以及促進骨形成標志物如RUNX2和1型膠原(collagentype1，COL1)的表達。由此可見，外泌體在血管外再生以及組織新生方面可能起到重要作用，而具體作用機制尚未明了。

3 外泌體與骨質疏松

骨質疏松癥是由多種原因導致的骨密度和骨質量下降，骨微結構破壞，造成骨脆性增加，從而容易發生骨折的全身性骨病。Liu等[38]利用間質干細胞移植技術(mesenchymal stem cell transplantation，MSCT)將正常小鼠的間質干細胞移植到狼瘡所致的骨質疏松表型的小鼠體內，結果發現正常BMSCs分泌的外泌體含有Fas蛋白，將正常的外泌體轉移至缺乏Fas蛋白的狼瘡所致的骨質疏松表型的小鼠體內后，結果miR-29b 含量顯著降低，而細胞內甲基化酶Dnmt1活性升高，進而Notch啟動子甲基化水平提高，抑制了Notch基因的表達，最終可以恢復小鼠BMSCs的成骨分化能力，增加小鼠股骨骨密度以及骨體積分數，促進骨形成，從而起到治療小鼠骨質疏松的作用。Zuo等[39]提取BMSC起源的外泌體通過靜脈注射入大鼠體內，發現可以顯著改善因放療導致的骨質疏松。Qi等[37]使用hiPSC-MSC-Exos+載體β-TCP支架技術治療骨質疏松合并顱骨缺損的大鼠，發現hiPSC起源的MSCs的外泌體可以顯著刺激顱骨缺損的骨再生和血管形成，且外泌體濃度越高，效果越明顯。以上對BMSCs外泌體的研究都在骨質疏松動物模型體內成功應用，也為人類骨質疏松的治療提供了新的思路和方法。

外泌體除了在治療前景方面值得關注以外，在作為骨質疏松的生物標志物、非侵入性的診斷工具以及疾病進展預后指標方面也有很高的應用前景。如前文所述，miR-214-3p以及miR-214-3已經在多個動物以及人體研究中被發現其在患有骨質疏松時顯著增加，可以作為骨質疏松的生物標志物[1,9]。另外還有研究[40]發現，在年齡大于55歲的骨質疏松患者的血漿中，miR-31水平較年齡小于25歲的健康對照組明顯升高，并證實了miR-31可能調控了與年齡相關的骨量減少以及骨質疏松的病理過程，未來將可能在骨質疏松的生物標志物以及診斷方面得到運用。

4 外泌體的應用前景

骨來源的外泌體提取簡單，操作侵入性小，從健康捐獻者的骨髓中即可以提取BMSCs來源的外泌體，同時可以在-20 ℃儲存6個月而不改變生物活性，便于儲存和運輸[41]；同時外泌體治療較細胞基礎的治療有毒性小，安全性高[42-43]。另外，因為外泌體不表達細胞表面的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)的MHC-I 和MHC-II，所以較以細胞基礎的移植治療降低了免疫原性。MSCs起源的外泌體同樣保存了特有的免疫特點，在未來可能幫助研究者發現新的免疫治療方法[44]。同時，與活細胞靜脈輸注相比，外泌體更加穩定，細胞內注射避免了異倍體的風險以及滯留于血循環遠端的微脈管系統堵塞。亦有實驗發現，MSCs和miRNA在骨修復和重建中起到重要作用[45-47]。以上發現表明了干細胞起源的外泌體在未來骨修復重建的臨床治療中可能具有重要的應用價值。

綜上所述，本文主要闡述了外泌體在成骨形成、破骨形成、血管形成中的作用以及在骨質疏松方面的應用。然而外泌體在骨重建中介導信號通路中具體分子機制的研究尚在初始階段，未來臨床應用也面臨著許多尚未解決的問題。但隨著研究的深入，新的外泌體也將逐漸被發現，外泌體與靶細胞的分子作用機制以及在骨質疏松臨床應用中的價值會被進一步挖掘，未來的應用前景將十分廣闊。