化學發光免疫分析法檢測乙肝病毒感染性標志物的價值評價

鄭赫

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV) 傳播途徑廣泛,且感染率極高［1］,患者一旦感染此病毒,隨著時間推移會逐漸發展為急性肝炎、慢性肝炎,嚴重者會發展成為肝硬化等疾病,給患者身心都帶來很大傷害［2］。如果可以及時診斷出乙肝病毒是否感染,可以通過治療有效緩解患者痛苦,并降低傳染率［3］。目前臨床上用于此項鑒定的方法主要有ELISA法,其可以對乙肝病毒感染性標志物進行定性分析,但是無法進行準確定量。CLIA 法有效結合了化學發光反應與免疫反應,其具有靈敏度高可以快速定量分析的優勢,從而彌補了ELISA 法存在的缺陷［4］。本文詳細分析了 ELISA 法和CLIA 法對乙肝病毒血清標志物的檢測結果,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017 年10 月～2018 年12 月收治的300 例乙肝患者作為研究對象,其中男180 例,年齡18～77歲,平均年齡(45.43±12.6)歲；女120例,年齡18～74歲,平均年齡(44.43±12.3)歲。所有患者均符合《WS299-2008乙型病毒性肝炎診斷標準》。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 離心機(型號：SV-II,山東博科科學儀器有限公司)、全自動酶免分析儀(型號：Bosal,上海通達生物科技有限公司)、化學發光法檢測儀(型號：HISCL-5000,日本希森美康公司)。

1.2.2 試劑 ①ELISA 試劑盒：HBsAg(武漢博士康生物工程有限公司,國 藥準字3400915,批 號C20161124、C20161125、C20161126)；HBeAg(上海領潮生物科技有限公司,國 藥準字3400525,批 號201609381、201609382、201609383)；HBeAb(上海領潮生物科技有限公司,國藥準字3400526,批號201610121、201610123),HBsAb(武漢博士康生物工程有限公司,國藥準字3400526,批號201610181、201610184),HBcAb(武漢博士康生物工程有限公司,國藥準 字3400526,批 號201610036、201610027)；②CLIA 劑盒：HBsAg(希森美康株式會社,國械注進20183401932,批號ZS8114、ZS8116)；HBeAg(希森美康株式會社,國械注進20183401629,批號EG2012、EG2014)；HBeAb(希森美康株式會社,國械注進20183401671,批號EB2011、EB2013)；HBsAb(希森美康株式會社,國械注進20183402425,批號SB2016、SB2018)；HBcAb (希森美康株式會社,國械注進20183401669,批號CB2014、CB2016)。

1.3 方法

1.3.1 血清處理 抽取患者早餐空腹靜脈血,隨后使用離心機于3500 rpm 離心15 min 后分離出血清。

1.3.2 ELISA 法 采用ELISA 試劑盒以及酶標儀進行檢測,一定要嚴格按照試劑盒說明及酶標儀的儀器說明進行操作,正式樣品測定同時要測定不同濃度的標準品作為最終的參照,質控選取定值參比血清,標本分別測定 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 共5 項指標。

1.3.3 CLIA 法 采用CLIA 試劑盒進行檢測,嚴格按照試劑盒要求進行,測定指標與ELISA 方法相同,同樣需要測定不同濃度的標準品作為最終的參照,質控選取定值參比血清。

1.4 觀察指標及判定標準 對比、分析ELISA 法及CLIA法乙肝病毒感染性標志物的檢測結果。①ELISA 的陽性判定標準：測定值≥上限參考值；HBsAg 參考值上限為0.2 ng/ml,HBsAb 上限參考值為10.0 mIU/ml,HBeAg 上限參考值為0.05 NCU/ml、HBeAb 上 限 參 考 值 為2.0 NCU/ml、HBcAb 的上限參考值為1.5 NCU/ml［4］。②CLIA 的陽性判定標準為：測定值≥上限參考值,其測定參考值同①。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法的檢測結果對比 標準樣本的回收率均在標準規定范圍內,此次檢測有效。300 例患者中,ELISA 法檢測HBsAg 陽性198 例(66.00%),HBsAb 陽性115 例(38.33%),HBeAg 陽 性247 例(82.33%),HBeAb 陽 性289 例(96.33%),HBcAb 陽 性221 例(73.67%)；CLIA 法 檢 測HBsAg 陽 性231 例(77.00%),HBsAb 陽 性161 例(53.67%),HBeAg 陽 性289 例(96.33%),HBeAb 陽 性290 例(96.67%),HBcAb 陽 性257 例(85.67%)。兩種方法HBeAb 陽性檢出率對比差異無統計學意義(P＞0.05)；CLIA 法HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBcAb陽性檢出率高于ELISA 法,差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 兩種方法的檢測結果分析 本次檢測中,兩種方法檢測同時為陽性：HBsAg 198 例,HBsAb 115 例,HBeAg 247 例、HBeAb 289 例、HBcAb 221 例；CLIA 法檢測為陽性但ELISA法檢測為陰性：HBsAg 33 例,HBsAb 46 例,HBeAg 42 例,HBeAb 1 例,HBcAb 36 例。CLIA 法檢測陽性的HBsAg 33 例中有32 例屬于低水平測定結果(平均值為0.3 ng/ml),HBsAb 46 例有40 例屬于低水平測定結果(平均值為10.5 mIU/ml),HBeAg 42 例有39 例屬于低水平測定結果(平均值為1.06 NCU/ml),HBcAb 36 例有35 例屬于低水平測定結果(平均值為1.52 NCU/ml)。當測定值顯著大于上限值時,ELISA 方法與 CLIA 法的陽性檢出率基本一致,CLIA 方法的檢出限顯著低于ELISA 法,低濃度時其敏感度更高。

3 討論

乙肝病毒是引起乙肝的病原體,其屬于嗜肝DNA 病毒科,該科病毒包含正嗜肝DNA 病毒屬和禽嗜肝DNA 病毒屬,引起人體感染的是正嗜肝DNA 病毒屬。乙肝病毒的感染是目前難以解決的全球性的公共衛生問題之一。其主要傳染源為急性乙肝患者、慢性乙肝患者和乙型肝炎病毒攜帶者,乙型肝炎病毒感染者的血液無論是處于潛伏期還是急性期或慢性期都具有傳染性［5］。HBsAg 陽性持續6 個月以上,沒有肝炎癥狀的體征,肝功能等各項檢查都顯示正常,血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)均在正常范圍,肝組織檢查顯示沒有明顯的異常癥狀稱為乙肝病毒攜帶者。慢性患者和病毒攜帶者作為傳染源的意義最大,其傳染性與病毒復制或體液中乙肝病毒的DNA 含量呈正比［6］。乙肝病毒主要的傳播途徑是血液傳播,其次是母嬰傳播,乙肝患者中通常有40%～50%的患者均來源于母嬰傳播,再次是密切接觸傳播,最后是醫源性傳播,如消毒不徹底、不安全注射等。

乙肝病毒的主要致病機理與肝細胞受損程度以及機體免疫應答的強弱有關,當病毒致機體免疫應答低下時,一旦發生乙肝病毒感染對外膜抗原的體液抗體應答利于清除血液中的病毒顆粒,對核殼和復制酶抗原的細胞免疫應答清除病毒的同時也損害肝細胞。其次,病毒變異產生耐藥性時,病毒會發生變異后的免疫逃逸,乙肝病毒在感染過程中由于人體免疫壓力和抗乙肝病毒藥物的影響易誘發變異,乙肝病毒變異后,可造成病毒不易清除并引起耐藥,降低抗病毒治療的療效。最后,抗體介導的免疫病理損害如HBsAb、前S1 抗體(PreS1-Ab)和前S2 抗體(PreS2-Ab)可直接清除血循環中游離的病毒,但抗原抗體形成的免疫復合物可沉積于腎小球基底膜、關節滑液囊等處并激活補體,引起Ⅲ型超敏反應,從而導致急性肝壞死,表現為重癥肝炎［7］。

常用的乙肝病毒感染的檢測指標即乙肝5 項：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb,可以在很大程度上反映被檢者體內乙肝病毒水平及機體的反應情況,粗略評估病毒的水平［8］。乙肝五項檢測分為定性和定量兩種,定性檢查只能提供陰性或陽性結果,定量檢查則可提供各項指標的精確數值,對乙肝患者的監測、治療評估和預后判斷等方面有更重要的意義,動態監測可作為臨床醫師制定治療方案的依據。

ELISA 法就是一種定性的方法,其反應機理是試劑可以使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性,使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開,最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化變為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。ELISA 可用于測定抗原,也可用于測定抗體。其重要的試劑種類為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體以及酶作用的底物(顯色劑)。CLIA 包含兩個部分,即免疫反應系統和化學發光分析系統?；瘜W發光分析系統是利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化,形成一個激發態的中間體,當這種激發態中間體回到穩定的基態時同時發射出光子(hM),利用發光信號測量儀器測量光量子產額。免疫反應系統是將發光物質(在反應劑激發下生成激發態中間體) 直接標記在抗原(稱為CLIA)或抗體(稱為免疫化學發光分析)上,或酶作用于發光底物。因此其反應原理的不同導致了其具有不同的靈敏度和檢測限。除去反應原理不同,兩種方法檢測過程也有很大區別,ELISA 法中手動加樣、孵育時間的確定以及手動洗板等因素可能會因為人員手法的不同從而導致結果具有差異性。

綜上所述,CLIA 法檢測分析檢測乙肝病毒感染性標志物時敏感度更高,檢測結果更準確。