從血管形成角度探究四物湯改善卵巢功能的機制

周凡茹，談秀娟，劉霞，李凡，張明敏

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030)

卵巢是女性生殖系統中重要的生殖器官，具有獨特的內分泌體系。卵巢的功能主要表現在周期性的卵泡募集、優勢化、排卵、黃體形成和退化，每個排卵周期都伴隨有周期性的血管形成，并且二者都受到激素的精密調節[1]。近來許多研究表明，卵巢血管系統對于卵泡激活、生長和存活以及產生高質量卵母細胞和維持妊娠黃體功能十分重要[2]。

中醫傳統理論認為女子以血為本，以氣為用，以肝為先天，肝藏血。《四診抉微·切診·診足脈》中又提出“蓋肝者，東方木也，生物之始，又夫人主血，而肝為血海，此脈不衰，則生生之機，猶可望也。”這表明血為人之本始，之于女子尤為重要。《素問·上古天真論》曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長。二七，而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……五七，陽明脈衰，面始焦，發始墮……七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。”由此可見“脈盛”“脈衰”與“腎氣”共同維護女性生理、生殖功能，氣血充盈、血脈通暢對于女性的正常生殖功能的維持和發揮十分重要。現代研究顯示，源自于血管形成相關的血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)，不僅參與了卵巢血管形成，而且與卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞以及卵細胞的發育高度相關，基于此種認識，本文圍繞卵巢中的血管形成過程，綜述現代研究中血管生成因子在其中的作用機制，結合四物湯的臨床作用和藥理研究，探討其改善卵巢功能、調經助孕的可能機制。

1 血管功能及形成

1.1 血管的功能

人體的血管系統由大量的血管組成，這些血管對于血液在整個循環系統的正常運行發揮重要作用，只有通過這種廣泛的動脈、毛細血管和靜脈網絡，細胞才能維持其功能、基本營養素的吸收以及細胞和代謝廢物的清除[3]。因此血管新生與成熟有助于許多生理過程，包括傷口愈合和修復、組織炎癥反應、生殖循環和眼睛成熟等[4-5]。

1.2 影響血管形成的相關因子

血管形成是一個復雜的過程，需要如整聯蛋白、血管生成素、趨化因子、連接分子、氧傳感器、內源性抑制劑等眾多刺激信號和抑制信號之間進行精細調控[6]。在這些因素中，VEGF、bFGF、ANG和PDGF是參與血管形成的重要因子。血管內皮生長因子(VEGF)是影響血管形成的關鍵作用因子，通過刺激血管通透性增高、內皮細胞增殖以及血管內皮的遷移和存活而起作用。然而，只有VEGF不足以形成成熟的血管網絡。

VEGF和FGF-2是新血管生長激活的主要調節因子，在血管通透性、內皮細胞增殖和募集中起主要作用。FGF-2通過刺激內皮細胞的遷移和增殖來誘導血管生成，并且促進平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖以維持血管穩定[7]。許多研究表明，VEGF和FGF-2具有協同作用能夠刺激血管生成。例如，FGF-2可誘導內皮細胞中VEGF及其受體的表達[8]。同時，VEGF又刺激內皮細胞產生FGF-2，進一步刺激細胞增殖和遷移[9]。

血管生成素(ANG)雖不是內皮細胞有絲分裂原，但對血管生成和血管完整性維持發揮重要作用。有研究表明，Ang-1募集內皮支持細胞以促進血管成熟并維持血管完整性，而Ang-2在早期血管生成中松動支持細胞基質，使現有血管結構不穩定，以允許諸如VEGF等的血管生成因子發揮刺激內皮細胞增殖和遷移的作用[6,10]。

涉及血管生成的另一個重要的生長因子是血小板衍生生長因子(PDGF)。PDGF家族至少由四個成員組成：PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C和PDGF-D，它們與兩種不同的受體結合，稱為PDGFR-α和PDGFR-β[11]。PDGF促進周細胞和平滑肌細胞的募集，對于血管成熟和維持穩定十分重要[12]。

此外，缺氧是血管床擴張的重要刺激因素。正常情況下細胞通過氧氣的簡單擴散進行氧化，但是當組織生長超過氧氣擴散閾值時，便會通過缺氧誘導因子激活血管形成。缺氧誘導因子能夠上調許多血管生成相關基因，但是對VEGF的誘導最為顯著，可以在數分鐘內使其上調高達30倍[13]，從而促進血管新生。

血管新生對生物的血液循環和器官組織構建至關重要,受到復雜而精細的調控，需要多種因子相互作用, 維持著一種動態平衡。在女性生殖生理中，卵巢是血管形成比較激烈的地方，周期性的血管形成維持著卵泡的生長發育和排卵，以及黃體功能的正常發揮，從而維持女性正常的月經，為妊娠的建立提供保障。

2 VEGF與卵巢功能

2.1 VEGF概述

VEGF是1989年從牛腦垂體濾泡星狀細胞體外培養液中首先純化出來的一種與肝素結合的同源二聚體糖蛋白激素,是血小板生長因子超家族的重要成員之一[14]。在人類中，VEGF家族由幾個成員組成:VEGF-A，VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D，VEGF-E和胎盤生長因子(PIGF)。VEGF受體家族主要由3個成員組成:VEGFR1/Fms-like tyrosine kinase-1(Flt-1)，VEGFR2/KDR/Flk-1和VEGFR3/Flt-4[15-16]。血管內皮生長因子及其受體系統參與血管和淋巴管的形成。VEGFR1和VEGFR2在血管內皮細胞顯著表達，在其中傳遞促血管形成的信號。VEGFR2有酪氨酸激酶活性，因此主要的血管形成信號是由VEGFR2產生的。VEGFR3特定表達于淋巴管內皮細胞，產生淋巴管形成的主要信號[17]。VEGF通過與其特定的受體結合啟動多條信號通路，目前對兩條基本通路進行了深入研究：Ras-MEK-MAPK通路和PI3K-Akt通路[18]。也有研究報道Akt/Girdin信號通路，促進VEGF依賴性的內皮細胞遷移和血管形成[19]。在卵巢組織中VEGF主要由顆粒細胞、膜細胞及黃體細胞合成[20]，并在卵泡血管形成、卵泡內氧化和黃體生成中起重要作用，進而影響卵泡成熟、卵母細胞質量、受精和胚胎發育能力[21]。

2.2 VEGF與卵巢血管形成

2.2.1 VEGF作用的血管形成促進卵泡的生長發育及排卵

卵巢中新血管的發育為卵泡生長和黃體形成提供必需的營養和激素供應[22]。通過對不同階段的卵泡觀察，發現竇卵泡前的卵泡(包括原始卵泡和次級卵泡)沒有獨立的血管網絡[23]，依賴于來自間質血管的氧氣和營養物質的擴散維持生長。在生長中的次級卵泡和更大的卵泡中，周圍的膜細胞有豐富的血管，而這些血管并不穿過基底膜。在卵泡破裂后、黃體形成過程中，血管形成加速進行，新生的血管逐漸浸潤到黃體中[24]。另外的研究顯示,無血管的顆粒細胞通過特定的基底膜與卵泡膜層分隔，毛細血管網絡在卵泡膜層發育[25]。因此卵泡的生長發育與周圍血管數量是一致的，膜細胞層獨立的毛細血管網絡的形成對于卵泡發育至關重要[26]，但不會穿透基底膜，從而使顆粒層和卵母細胞維持完全無血管的狀態直至排卵[27]。

排卵前優勢卵泡具有豐富的血管網絡，在排卵中發揮重要作用。使用脈沖多普勒技術測量婦女的卵巢血流量提示有優勢卵泡的卵巢血流量增加，并且隨著卵泡大小的增加峰值流速增加，優勢卵泡排卵前的血管化和流速增加[23]。在一項對單卵生物的研究中表明，優勢卵泡的選擇過程與血管生成密切相關，優勢卵泡比其他卵泡具有更密集的毛細血管網，其周圍增加的血流量和血管舒張是排卵期卵泡中發生的特征性事件[28]。

此外，卵泡的生長發育是與血管發生相輔相成的。多項研究表明,次級卵泡的顆粒細胞和卵泡膜細胞都表達VEGF及其受體，并且VEGF的產生是階段依賴性的，隨著卵泡的增長，卵泡液的VEGF含量增加[29]。VEGF可以通過促進血管新生和增加細胞通透性，從而增加對卵泡生長重要的生長因子的供應，如促性腺激素、類固醇和氧氣等[30]。最近的一項研究提出了一個新的概念，即卵丘細胞獲取表皮生長因子受體反應性是卵泡血管形成的一個發育標記，類似于在壁顆粒細胞中FSH誘導的LH受體信號的作用[31]。這個研究打開了新的思路，為研究卵泡血管形成的起點提供了突破。

2.2.2 VEGF促進黃體血管形成及功能維持

黃體是少數由另一個器官的殘余物形成的內分泌腺體之一，其功能和存活有范圍和時間限制。黃體是顆粒細胞、卵泡膜細胞、毛細血管和成纖維細胞快速重塑、生長、分化和死亡的位點。黃體的形成、維持、消退和類固醇生成是哺乳動物繁殖中最重要且受到嚴密調控的事件之一[32]，而黃體的血管形成對于黃體結構和功能的發揮至關重要[33]。

在排卵期間，分隔卵泡無血管顆粒層和血管化基質層的基底膜分解，毛細血管進入并迅速萌芽，侵入顆粒細胞層并廣泛增殖。排卵后，卵泡形成高度血管化的黃體，分泌大量黃體酮以維持子宮妊娠的能力。有研究者將卵巢內的血管重構與快速增長的腫瘤進行比較，發現黃體建立的血管密度和血流量的速率與其他器官相比是最高的[2]。對人類卵巢進行脈沖多普勒的研究表明,黃體具有高流量，低阻力循環，超過85%增加的流量是流向黃體的。相比身體其他組織，黃體具有單位質量最高的血液供應，是腎臟組織的8倍[34]。然而，如果在2周內沒有懷孕，黃體消退，將形成無血管殘余，成為白體[23]。據報道，白體實際上是非血管性的，然而血管供應仍然可以在這個黃體階段中及在退化黃體的血管重塑階段找到，血管生成仍然存在[35]，所以退化黃體中的血管形成的存在及其作用還有待進一步研究。

此外，一些研究表明血管內皮生長因子具有維持黃體期形成的發達的血管網絡的功能，因為在血管生成后階段使用VEGF抑制劑會導致內皮細胞死亡[36]、組織缺氧[37]并上調緊密連接蛋白，從而降低了血管滲透性[38]。

在卵巢中，卵泡發育和血管形成緊密相關,VEGF可以通過促進卵泡及黃體周圍的血管形成，調節卵泡發育的微環境，因此，關注VEGF對于卵巢的作用，對于我們臨床改善卵巢功能的治療具有指導意義。

3 血脈理論與四物湯

3.1 血脈理論研究

《素問·上古天真論》曰：“……二七，而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……五七，陽明脈衰，面始焦，發始墮。六七，三陽脈衰于上，面皆焦，發始白。七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。”由此可見脈之“通”“盛”“衰”“虛”貫穿女性的一生，與女性生殖功能的發揮和維持密不可分。古人認為“女子無子,多因經候不調”(《萬氏女科》)，故“求子之道,莫先調經”(《丹溪心法》)，而月經的主要成分是血，血液于脈中正常運行，周流不息，方能發揮正常作用。因此，女子調經必先養血，養血之余，亦不忘通脈，脈通而血足，經調則子成。

《靈樞·五音五味》篇提到：“婦人之生，有余于氣，不足于血，以其數脫血也”。表明婦人的體質特點是氣有余而血不足，從而說明血之充盛對于婦人生理健康的十分重要。中醫學認為，血是循行于脈中而富有營養的液態物質，是構成人體和維持人體生命活動的基本物質。《靈樞·邪客》曰：“營氣者，泌其津液，注之于脈，化以為血”。因此，血不僅是有營養作用的液態物質，還具有一個重要特征，便是行于脈中。

所以女子血之為病，除了補血養血之外，更應注重活血調血，使脈道通利，血行脈中，通而不滯，才能發揮其正常功用。而中醫對于血之通道的經脈、血脈、脈絡等的認識至今未有統一明確的界定。清代醫家王清任《醫林改錯》中說“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣必停留為瘀”，已將脈稱為血管。近代的《竹泉生女科集要》則對血脈、脈絡、血絡等做出了統一解釋：“分走于筋骨肌肉關節，而偏乎周身，血管即在其中，自臟腑入三焦，而外達于遍體，枝干交錯，絡繹不絕，血走管中，隨氣而動，是為動脈也，固曰脈絡，又曰隧道，而統謂之血脈，亦謂之血絡”。此處更為直接的將傳統的血脈定義歸為現代的血管。更重要的是，吳以嶺先生系統整理繼承幾千年來中醫學關于血脈與脈絡病變的豐富論述和治療經驗，將脈絡與經絡區分開來，首次提出以研究“脈絡—血管系統病”為主的脈絡學說，并提出“脈”作為獨立的實體臟器具有其自身結構、功能與代謝特征[39]。基于此脈絡學說理論認識，我們將傳統的血脈功能與現代的血管作用聯系起來，以“女子血之不足”“任通脈盛而有子”為理論基礎，探究四物湯作為婦科經方的意義和價值。

3.2 四物湯及類方

四物湯，出自唐·藺道人《仙授理傷續斷秘方》，主治跌打損傷、腸肚中瘀血，將其應用于婦科疾病則首見于宋代《太平惠民和劑局方》，四物湯的藥物組成是由《金匱要略·婦人妊娠篇》中的芎歸膠艾湯去阿膠、艾葉、甘草而成，是中醫婦科最常用的調經、種子打底方。

《醫方考》有云：“當歸入心脾，芍藥入肝，熟地入腎，乃川芎者，徹上徹下而行血中之氣者也。此四物湯所以為婦人之要。”四物湯基于補血，重在調血，補血而不滯血，行血而不傷血，溫而不燥，滋而不膩，為補血調經的基礎方，療效顯著，臨床應用廣泛。四物湯雖有穩定的配伍結構，但在臨癥時為了辨證施治，常有不同的加減側重。

四物湯類方對多種證型的婦科血瘀證痛經均有良好療效，如氣滯血瘀型，四物湯加理氣止痛藥木香、香附、延胡索等組成香附四物湯;寒凝血瘀型，四物湯加溫經散寒藥肉桂、干姜、小茴香等組成少腹逐瘀湯;瘀熱兼夾型，四物湯加清熱除濕藥黃連、黃芩組成芩連四物湯;血虛血瘀型，四物湯加桃仁、紅花組成桃紅四物湯[40]。然而不論四物湯如何化裁變化，均是以補血活血、去瘀通脈為核心，虛者補之，寒者溫之，熱者清之，瘀者行之，從而調節女子“血不足而氣有余”的機體狀態，被朱丹溪稱為“婦人眾疾之總司”[41]。

3.3 四物湯現代研究

對現有的中、英文文獻資料進行檢索，分析出四物湯的主要生物活性成分包括芍藥苷、芍藥醇、沒食子酸、阿魏酸、z-藳本內酯、川芎嗪、洋川芎內酯A和梓醇[42]。既往的許多研究提示四物湯具體的功效主要體現在以下幾個方面:1)調節內分泌和補充微量元素；2)促進造血和糾正貧血；3)抗血小板的聚集和抗血栓的形成；4)免疫調節及抗自由基；5)抗輻射、藥物損傷及抗突變；6)抑制子宮活動等方面[43-46]。

最新的一些研究表明，四物湯主要生物活性成分之一的川芎嗪在體外和體內通過抗氧化應激特性和抑制細胞凋亡表現出神經保護作用。一些研究人員還證實了川芎嗪通過不受調節的VEGF信號通路對血管生長具有保護作用[47]。此外，另有研究顯示四物湯的主要生物活性成分z-藳本內酯可以減弱血管炎癥并激活內皮細胞的防御系統從而產生血管保護作用[48]。由此可見，四物湯的多種活性成分對于血管形成和血管穩定發揮重要作用。

近期的一項采用生物醫學方法的研究顯示,四物湯和四君子湯通過多條途徑促進人體生長發育，增加血流量，促進造血功能，維持子宮正常發育，改善痛經和其他與雌激素相關的疾病，這與中醫的血與氣的作用是一致的。該研究中特別闡述了四物湯具有影響氨基酸和碳水化合物代謝的功能，能夠通過影響抑制性突觸(GABA能突觸)來調節下丘腦垂體腎上腺和性腺軸的功能活動，以刺激雌激素和類固醇激素分泌，從而改善卵巢功能[49]。

卵巢的結構和功能在育齡期呈現周期性變化特點，并且卵巢是對損傷因素極其敏感的器官，如放化療、缺血缺氧以及氧化應激都可能導致卵巢功能永久性損傷，乃至衰竭[50]。最新的研究顯示,四物湯中多種活性成分能夠激活芳香化酶影響雌激素水平，并且產生抗氧化作用從而改善可能由卵泡發育不良引起的月經紊亂[51]。Liu等人的研究顯示，四物湯對抗過氧化氫誘導的氧化損傷的細胞保護活性可能部分通過Nrf2的激活介導[52]。多個研究顯示通過激活Nrf2/HO-1和HIF-1α/VEGF信號傳導途徑可以上調抗氧化應激活性并促進血管生[53]。并且已有研究表明四物湯可以通過調節Nrf2/HO-1和NO在人臍靜脈內皮細胞中發揮血管保護作用[54]。缺氧誘導因子(HIF1α)似乎是刺激類固醇合成急性調節蛋白(StAR)表達的正調節因子，其在部分缺氧下能夠增加顆粒細胞的類固醇生成能力[55]。同時HIF-1α是VEGF表達的主要調節因子，參與卵巢的血管生成，并且其定位會在卵巢周期的不同功能階段發生變化[37]。因此我們可以推測四物湯能夠改善卵巢局部含氧微環境，影響血管形成及卵巢激素水平，從而實現對卵巢功能的調節作用。

中醫學認為，女子以血為根本，經、孕、產、乳皆以血為基礎，婦科疾病的發生主要在于血、氣，多與血瘀有關，因此在治療時主要采用活血化瘀法。四物湯作為“婦科第一方”，以血證立法，補血配活血，動靜相伍，補血而不滯血，行血而不傷血，對活血化瘀法的建立及應用具有重要意義。因此，用現代科學方法重新解讀四物湯，從血管形成角度深刻認識補血活血理論，并且全方位剖析四物湯的可能作用機制，對于臨床治療婦科疾病將會有更深遠的影響。

4 小結

中醫藥在婦科領域的應用越來越多，經典方劑——四物湯在改善女性卵巢功能、提高生育能力方面已有一定的臨床基礎，然而其具體的作用靶點和作用通路仍未有精確闡明。筆者通過探究血管形成的過程，血管形成對于卵巢卵泡發育、卵巢微環境調節的意義，卵巢血管形成過程中的重要因子VEGF的生理特性和作用特點，并結合傳統醫學對于血脈理論的認識和進展，以及女子以血為用的傳統理論認為：四物湯可能通過調節卵巢局部微環境、促進卵巢血管形成從而改善女子卵巢功能，最終實現調經助孕的目的。卵巢微環境呈現周期性的動態變化，血管周期性的生長與崩解是其最顯著的特征；四物湯具有養血活血的特點，熟地黃與芍藥、當歸與川芎又呈現動靜結合的配伍特色，這既符合卵巢周期性變化的特點，也充分展示了中醫氣血、陰陽互根互用的理念。因此，深入挖掘并掌握四物湯的藥理特性，探究其養血活血的特點在改善卵巢功能中的機制，定會促進以四物湯為基礎方的婦科常用方劑的臨床應用，給傳統醫學應用提供新的思路。