組蛋白H3甲基化修飾與精子發生的研究進展

王龍達 羅啟睿 趙樹華

（1 昆明醫科大學第一附屬醫院生殖遺傳科，云南 昆明 650031；2 云南大學附屬中學呈貢校區，云南 昆明 650500）

1 前言

哺乳精子發生是一個復雜獨特的過程。以小鼠為例，精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSC）分化為精原細胞前體（progenitor spermatogonia），隨后經A型精原細胞（spermatogonia）、B型精原細胞進入減數分裂，減數分裂Ⅰ期包括四個階段初級精母細胞（spermatocyte）：細線期（leptotene）、偶線期（zygotene）、粗線期（pachytene）和雙線期（diplotene），然后第二次減數分裂分裂為4個圓形精子細胞（round spermatid），經形態和染色體巨變特化為精子[1]。在這一復雜的過程中，每個階段都涉及大量的特異基因表達和關閉，這些基因的調控廣泛依賴于表觀遺傳。越來越多的證據表明，組蛋白修飾與男性不育相關，組蛋白修飾異常影響正常精子發生[2]。

組蛋白修飾是重要的表觀遺傳修飾機制，包括組蛋白甲基化（methylation，me）、乙酰化（acetylation，ac）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等，參與了基因轉錄調控和染色質結構等眾多調控過程[2]。蛋白甲基化存在于賴氨酸（Lysine，K）和精氨酸（Arginine，R）殘基，分別通過賴氨酸甲基化轉移酶（protein lysine methyltransferases，PKMTs）或精氨酸甲基化轉移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）將甲基從供體Ado-Met轉移到蛋白殘疾上[2]。組蛋白甲基化是研究最多的翻譯后修飾，不同位點的甲基化代表了不同的染色質狀態，在精子發生的多個階段發揮重要作用[2]。H3是甲基化修飾最普遍、研究最多的組蛋白。為更好的理解精子發生過程，本文擬綜述H3組蛋白各甲基化位點在睪丸中的分布及功能。

2 結果

2.1 精子H3組蛋白修飾與不育：精子發生過程中，單倍體的精子細胞染色質經歷劇烈變化，90%～95%核小體組蛋白先被轉換蛋白替換（transition protein，Tnp），然后被魚精蛋白替換（protamine，Prm）[2]。魚精蛋白使染色質形成緊密的結構，防止DNA損傷和突變[2]。殘留組蛋白也具有重要功能，殘留比例與男性不育相關。有研究表明，精子H3組蛋白27位賴氨酸殘基三甲基化（H3K27me3）與公牛生育力相關[3]。此外，通過染色質免疫共沉淀-基因芯片分析，發現高生育力水牛和低生育力水牛精子中有很多基因的H3K4me2和H3K27me3存在顯著性差異[4]。另外，在精子中殘留的組蛋白有一重要作用是通過H3K4me3（激活標記）和H3K27me3（抑制標記）使在胚胎早期發育中起重要作用的基因維持“二價”狀態，以在受精后順利激活表達，促進胚胎發育[2]。

2.2 H3K27甲基化修飾在精子發 生中的作用：H3K27甲基化是抑制性組蛋白修飾，在各級生精細胞中均有分布，主要通過Polycomb抑制復合體2（Polycomb repessive complex 2，PRC2）催化完成[5]。PRC2包括4個主要組分：EZH1/2、EED、SUZ12、和RBBP4/7[6]。在生精細胞中特異敲除PRC2核心基因Eed和Suz12都導致小鼠不育，表型相似，表現為睪丸體積顯著減小，組織切片顯示精母細胞數量大幅下降，且多數細胞核不規則，粗線后精母細胞和圓精子完全缺失[7]。PRC2另一個核心組分EZH1和EZH2的同時敲除，也導致H3K27me3下降和減數分裂阻滯[8]。精子發生的早期，從精原干細胞分化到減數分裂起始，需要開啟一組基因轉錄。如Stra8在這一有絲分裂到減數分裂轉換過程中起著至關重要的作用[9]。組蛋白修飾參與Stra8的表達調控，Stra8啟動子的H3K27me3修飾在精原干細胞分化和減數分裂起始階段降低，隨著減數分裂的進行，在精母細胞中H3K27me3又上升，Stra8表達下降[7]。在小鼠中的研究結果表明，H3K27甲基化參與了精原干細胞維持，減數分裂前期轉換，減數分裂染色體配對、聯會和交叉等過程[7-8]。

2.3 H3K4甲基化修飾在精子發生中的作用：H3K4的二甲基化（H3K4me2）和三甲基化（H3K4me3）是基因激活的標記，由不同的甲基化酶和去甲基化酶調控[10]。H3K4me3主要分布在減數分裂起始階段的B型精原細胞、細線期和偶線期精母細胞，以及精子形態發生階段的圓形和長形精子細胞中[10]。KMT2在生精細胞中表達，催化H3K4me2。敲除Kmt2的小鼠不育，生精細胞漸進性缺失[10]。H3K4me2在精原干細胞維持中具有重要功能。PRDM9催化H3K4me2三甲基化，敲除Prdm9導致H3K4me3降低，減數分裂阻滯，雄鼠不育[11]。進一步研究發現H3K4me3參與調控染色體同源配對和性小體（sex body）生成[11]。此外，H3K4me3還參與組蛋白-魚精蛋白替換，PYGO2蛋白識別H3K4me3并特異定位于長形精細胞核中[12]。小鼠中，Pygo2敲除影響轉換蛋白（Tnp）和魚精蛋白（Prm）表達，導致細胞核凝集異常，進而導致不育。PYGO2通過識別H3K4me3促進H3乙酰化，進而促進組蛋白-魚精蛋白替換[12]。此外蛋白PHF7蛋白也可以識別H3K4me2/3，催化H2A泛素化促進組蛋白-魚精蛋白替換[13]。以上結果說明，H3K4甲基化主要參與了精原干細胞維持/分化，減少分裂，組蛋白-魚精蛋白替換等重要的精子發生過程。

2.4 H3K9甲基化修飾在精子發生中的作用：H3K9三甲基化（H3K9me3）是抑制性組蛋白修飾，多發生于異染色質區域。H3K9me3主要分布在所有生精細胞中具有分布[14]。SUV39H1和SUV39H2在中心粒外周異染色質區域催化H3K9三甲基。Suv39h1廣泛表達，而Suv39h2在睪丸特異表達。同時敲除這兩個基因，導致異染色質松散，進而同源染色體無法配對，減少分裂異常，雄鼠不育[11]。SETDB1是另一個催化H3K9三甲基化的酶，該酶缺失導致精原干細胞凋亡。SETDB1通過調控PTEN/AKT/FOXO1通路抑制維持精原干細胞。SETDB1可以與AKT結合，并調控 Bim 和Pten基因H3K9me3抑制它們的表達，進而抑制細胞凋亡[14]。JHDM2A是一個H3K9me2/1特異的去甲基化酶，小鼠中Jhdm2a基因的缺失，導致精細胞染色質凝集異常，從而導致不育。JHDM2A直接與轉換蛋白（Tnp1）和魚精蛋白（Prm1）啟動子的H3K9甲基化結合并調控基因表達，從而調節組蛋白-魚精蛋白替換[12]。此外，H3K9甲基化在精子發生過程中的逆轉座子抑制中具有重要功能，以維持精子DNA完整性[15]。綜上所述，H3K9甲基化主要參與經原干細胞維持、減數分裂及組蛋白-魚精蛋白替換。

2.5 H3K36在精子發生中的作用：H3K36三甲基化（H3K36me3）主要在基因上富集，是激活性修飾，主要分布在精母細胞和圓形精子細胞中[16]。SETD2也稱為HYPB和KMT3A是H3K36me3的主要甲基化酶，主要在小鼠睪丸的粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達[16]。SETD2介導的H3K36me3是一個與轉錄耦聯的組蛋白修飾標志，在轉錄激活的基因上富集。敲除Setd2導致粗線期精母細胞和圓形精細胞中H3K36me3完全消失，精子發生停滯在圓形精子階段，頂體發生異常[16]。SETD2缺失影響精子形態發生相關蛋白的表達包括頂體結合蛋白1（ACRBP1）、轉換蛋白、魚精蛋白等，進而影響組蛋白-魚精蛋白替換[14]。因此，H3k36me3主要在減數分裂后精細胞中起作用，參與精子形態發生和組蛋白-魚精蛋白替換。

2.6 H3K79甲基化修飾在精子發生中的作用：H3K79的甲基化較為特異，只存在于長形精子細胞中，主要由甲基化酶DOT1L介導[12,17]。在果蠅中，Dot1l同源基因Grappa通過H3K79me直接參與組蛋白-魚精蛋白替換。與果蠅中相似，小鼠Dot1l基因主要在減數分裂后在精細胞中表達，在染色質重組過程中，H3K79me3伴隨著組蛋白H4的高乙酰化，H4的高乙酰化使染色質呈現松散狀態，有利于組蛋白被替換蛋白替換，從而促進組蛋白-魚精蛋白替換[12,17]。小鼠和人精子細胞H3K79me2/3主要發生在組蛋白替換期，在大鼠中，H3K79直接介導替換蛋白定位與染色質[12,17]。因此，H3K79甲基化是組蛋白-魚精蛋白替換所必需的。

3 展 望

本文簡要介紹了H3組蛋白賴氨酸位點的甲基化修飾在生精細胞中的分布和主要功能。不同的甲基化修飾呈現不同的生精細胞分布模式，行使不同的生物學功能，參與了生精過程的各個階段。然而，現有組蛋白修飾功能證據主要來自于對甲基化酶的功能研究。甲基化酶的功能可以反映對應組蛋白修飾的作用，但是由于甲基化酶和組蛋白修飾不是一一對應的，因此，要明確組蛋白甲基化的具體功能，還需更直接的證據。未來隨著技術的發展，利用高通量單細胞組蛋白修飾檢測技術結合轉錄組及其他單細胞表觀遺傳組學分析，將可能為破解精子發生過程中的組蛋白修飾“密碼”提供更充分的證據。另外，環境是影響生精功能的重要因素，比如吸煙、酗酒等。組蛋白修飾是這些因素的潛在作用靶點，但是具體作用機制也有待于深入研究。總之，揭示組蛋白修飾在精子發生中的作用和機制，有助于理解男性不育治病機制，提供潛在治療靶點及理論支撐。