連翹酯苷A通過p38 MAPK/NF-κB信號抑制哮喘氣道炎癥①

林 星 李俊峰 車 楠 李良昌③ 李 莉③

(延邊大學附屬醫院胸外科,延吉 133000)

過敏性哮喘(Allergic asthma)通常由過敏原吸入引起，是一種異質性炎癥性疾病。哮喘主要病理特征包括嗜酸性粒細胞浸潤為主的氣道炎癥，氣道高反應性及后期的氣道重塑[1,2]。現在普遍認為慢性炎癥在哮喘的發生發展中具有重要的作用，但具體機制尚不清楚。哮喘治療通常使用皮質類固醇藥物，但常伴有一系列不良反應，例如抑制下丘腦-垂體軸，減少骨生長和增加機會性感染的風險[3]。因此，迫切需要尋求安全有效的治療哮喘的治療藥物。

連翹酯苷A(Forsythiaside A,FSA)是一種從中草藥連翹中分離出來的活性成分，具有抗炎作用[4]。據報道，FSA抑制BV2小膠質細胞中LPS誘導炎性細胞因子的產生[5]。然而，目前尚不清楚FSA是否對哮喘有保護作用。在這里，我們建立了OVA誘導的哮喘模型，觀察FSA對OVA哮喘炎癥的影響并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 BALB/c小鼠購自延邊大學實驗動物中心，合格證號為：SCXK(吉)2018-0007。將小鼠飼養在溫度受控的室內，12 h光照/黑暗循環，隨意提供食物和水。所有動物實驗均按照延邊大學醫學院的實驗動物護理和使用指南進行。遵循相關動物保護法，實驗中盡量減少動物痛苦。

1.1.2試劑 連翹酯苷A(Forsythiaside A，FSA，純度>98%)購自國家藥品和生物制品控制研究所(北京)。OVA、氫氧化鋁凝膠購自美國Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。小鼠IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的ELISA試劑盒購自R&D Systems(Minneapolis，MN)。IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、p-p38 MAPK、p38 MAPK、NF-κB p65和β-actin抗體均購自Santa Cruz公司(Santa Cruz，CA，USA)。

1.2實驗方法

1.2.1OVA哮喘小鼠模型建立 40只小鼠隨機分為5組：正常組(CON)，哮喘模型組(OVA)，FSA低劑量組(FSA 15)，高劑量組(FSA 30)和地塞米松組(DEX)。在第1天和第14天通過腹腔注射2% OVA和氫氧化鋁的PBS混合液200 μl致敏，CON組小鼠注射相同體積的PBS。在第21至23天，以1% PBS OVA溶液15 ml霧化激發30 min。每次OVA激發前，FSA 15組和FSA 30組分別按15和30 mg/kg，DEX組按照10 mg/kg劑量進行灌胃。

1.2.2BALF細胞分類計數 參照文獻方法[6]，最后一次OVA激發后24 h處死小鼠，1 ml的PBS氣管灌洗后收集BALF，細胞計數板計數細胞總數，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集上清液用于細胞因子檢測。將細胞沉淀涂片后Diff-Quik染色，高倍鏡下進行細胞分類計數。取小鼠左肺上葉10%甲醛固定，石蠟包埋。右肺剪碎后放入液氮中速凍，保存于-80℃冰箱，待用。

1.2.3BALF中細胞因子測定 根據生產商的說明，采用ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)檢測BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ的含量。

1.2.4小鼠肺切片組織學染色 石蠟包埋的肺組織切片后，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，進行HE、PAS和Masson染色后，每只小鼠隨機選3張切片，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.5免疫組織化學染色 切片60℃熔蠟，檸檬酸鹽修復抗原，3% H2O2孵育10 min，血清封閉后p-p38 MAPK和NF-κB p65抗體4℃過夜，第2天，二抗孵育30 min后DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。

1.2.6Western blot免疫蛋白印跡 參照文獻方法[7]，蛋白提取后BCA方法測定蛋白濃度。12%膠分離蛋白質樣品，半干法轉移到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉后，IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65和β-actin一抗(1∶1 000稀釋)4℃過夜。第2天，TBST洗滌膜3次，并與HRP標記的二抗室溫孵育2 h。ECL發光后美國GE AI600凝膠成像儀進行攝像分析。

2 結果

2.1FSA對哮喘小鼠BALF中炎癥細胞的影響 計數各組小鼠BALF炎癥細胞總數(Total cells)后進行Diff-Quik染色(如圖1所示)。對BALF中炎癥細胞進行分類計數(如表1所示)，結果顯示，OVA組小鼠炎癥細胞總數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量明顯高于CON小鼠，然而，FSA及地塞米松處理可顯著抑制各炎癥細胞及炎癥細胞總數的增加(P<0.05)。

2.2FSA對哮喘小鼠BALF中Th1/Th2因子的影響 與CON組小鼠比較，OVA組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13的含量顯著升高，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，經過FSA及地塞米松處理后，IL-4、IL-5、IL-13含量降低而IFN-γ含量顯著升高，與OVA組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖1 小鼠BALF中細胞Diff-quik染色(×200,箭頭所示為嗜酸性粒細胞)Fig.1 Diff-quik staining of cells in BALF of mice(×200,the arrow shows eosinophils)

2.3FSA對小鼠肺組織病理學改變的影響 HE染色結果顯示，CON組小鼠氣道壁及其周圍軟組織結構完整，無炎癥細胞浸潤。OVA激發小鼠可見氣道壁增厚，黏膜水腫，小血管及細支氣管周圍炎癥細胞廣泛浸潤，部分黏膜上皮可見損傷及脫落。而FSA及地塞米松處理后，小血管及細支氣管周圍炎癥細胞浸潤減少，氣道平滑肌增生不明顯，氣道結構較為完整。PAS染色顯示OVA組中PAS陽性細胞顯著增多，但可被FSA及地塞米松抑制。Masson染色顯示OVA組小鼠氣道下膠原沉積較CON組小鼠明顯增多，而FSA處理可對這種膠原沉積發揮抑制作用，如圖2所示。

2.4FSA對哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ表達的影響 Western blot結果表明，與CON組小鼠比較，OVA組小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13表達增多，IFN-γ表達減少(P<0.05)，經過FSA及地塞米松處理后，OVA誘導哮喘小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13表達降低，IFN-γ表達升高，與OVA組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，如圖3所示，與ELISA結果相符。

2.5FSA對p38 MAPK磷酸化及NF-κB活化的影響 如圖4A所示，免疫組化結果顯示，OVA組小鼠肺組織中p-p38 MAPK和NF-κB p65陽性細胞較CON組小鼠增加，而在不同劑量FSA組及地塞米松組中陽性細胞數較OVA組明顯減少。同時Western blot結果表明，與CON組比較，OVA組小鼠肺組織中p-p38 MAPK和NF-κB p65水平明顯升高，而不同劑量FSA及地塞米松處理后，其含量降低，與OVA組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，如圖4B、C所示。

GroupsTotal cellEOSNEULYMCON2.32±0.230.07±0.040.11±0.080.48±0.12OVA7.65±0.551)5.23±0.361)0.39±0.101)1.42±0.361)FSA 156.36±0.582)4.34±0.422)0.32±0.092)1.36±0.122)FSA 304.26±0.312)3.36±0.222)0.18±0.082)0.98±0.152)DEX3.19±0.252)0.98±0.182)0.14±0.062)0.75±0.172)

Note：Vs CON group,1)P<0.05;vs OVA group,2)P<0.05.

GroupsIL-4IL-5IL-13IFN-γCON78.65±7.49 70.45±7.4939.46±7.3273.21±4.59OVA292.48±12.691)456.41±18.291)89.62±6.321)23.49±2.391)FSA 15251.24±10.412)421.28±17.212)76.36±7.362)46.47±3.282)FSA 30174.69±9.122) 275.69±14.982)65.78±6.252)52.38±4.512)DEX126.27±8.912) 149.78±10.262)43.52±5.162)69.47±5.842)

Note：Vs CON group,1)P<0.05;vs OVA group,2)P<0.05.

圖2 FSA對小鼠肺組織病理改變的影響(×200)Fig.2 Effect of FSA on pathological changes of lung tissue(×200)

圖3 FSA對小鼠肺組織中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ表達的影響Fig.3 Effect of FSA on expression of IL-4，IL-5，IL-13 and IFN-γ in lung tissue of miceNote:Vs CON group，#.P<0.05;vs OVA group，*.P<0.05.

圖4 FSA對OVA誘導哮喘小鼠肺組織中p-p38 MAPK和NF-κB p65表達量的影響Fig.4 Effect of FSA on expression of p-p38 MAPK and NF-κB p65Note:A.Immunocytochemistry staining for p-p38 MAPK and NF-κB p65 in lung tissue(×200);B.Western blot of p-p38 MAPK in lung tissue.C.Western blot of NF-κB p65 in lung tissue.Vs CON group,#.P<0.05 ;vs OVA group,*.P<0.05.

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的呼吸系統慢性炎癥性疾病，其病理特征包括炎癥細胞廣泛浸潤、杯狀細胞增生并過量分泌黏液、氣道下膠原沉積等。在哮喘的發病過程中，炎癥細胞顯著增多并廣泛浸潤到氣道周圍是哮喘最主要的特征，其中，浸潤細胞以嗜酸性粒細胞為主，也包括中性粒細胞、淋巴細胞等[8]。本實驗中HE染色結果表明，FSA有效改善了OVA誘導哮喘小鼠支氣管及血管周圍炎癥細胞的浸潤。此外，對各組小鼠BALF中炎癥細胞進行分類計數后發現，FSA顯著減少了哮喘小鼠模型BALF中各炎癥細胞及總炎癥細胞數量的增加。氣道上皮中杯狀細胞增生并分泌過量黏液也是哮喘的重要特征，本實驗的PAS染色結果表明，FSA可有效緩解OVA誘導哮喘小鼠氣道上皮中杯狀細胞的增生，并可抑制氣道黏液的過量分泌。此外，Masson染色結果表明，FSA可抑制氣道下膠原沉積。因此，FSA可有效改善OVA誘導哮喘小鼠模型的氣道炎癥反應。

在哮喘的發生、發展中，除了炎癥細胞的參與，細胞因子也發揮著重要作用。IL-4、IL-5和IL-13主要由Th2細胞產生并分泌，Th2細胞的分化與聚集是哮喘炎癥反應加重的重要原因，而Th1細胞可產生IFN-γ等，據研究表明，提高Th1反應可抑制哮喘的發展[9]。因此，本實驗分別檢測了各組小鼠BALF和肺組織中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ水平。結果表明，FSA處理可顯著減少哮喘小鼠BALF及肺組織中IL-4、IL-5、IL-13水平，提高IFN-γ水平，因此，FSA可通過降低Th2細胞因子，提升Th1細胞因子而糾正OVA誘導的哮喘小鼠Th1/Th2失衡。

為了探究FSA緩解哮喘炎癥的可能機制，我們研究了p38 MAPK/NF-κB信號通路。p38 MAPK是MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)家族的成員之一，在受到刺激時發生磷酸化而激活，從而參與多種生物學效應，如調控炎癥反應等[10]。本次實驗中免疫組化及Western blot結果表明，FSA可以減少哮喘小鼠肺組織中p38 MAPK磷酸化水平。NF-κB是一種轉錄因子，與包括哮喘等多種炎癥反應密切相關。通常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκBα結合存在于細胞質中，當細胞受到相關因子刺激時，IκBα發生磷酸化并被降解，而將NF-κB活化、分解為p50和p65并轉移至核內，與調控基因的啟動子序列結合并調節其轉錄[11]。目前已有大量研究表明，支氣管哮喘的氣道炎癥反應與NF-κB活化密切相關。本次研究中，通過免疫組化及Western blot發現，FSA可顯著降低NF-κB p65表達水平并阻礙其入核。大量研究結果發現，p38 MAPK在受到刺激時可發生磷酸化，磷酸化的p38 MAPK可使有絲分裂原和應激活化蛋白激酶1(MSK1)發生磷酸化，繼而激活NF-κB[12]。活化的NF-κB可調控多種炎癥分子表達，如IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ等，調控Th1/Th2細胞因子水平，發揮其炎癥調控作用[13]。

綜上所述，FSA可以顯著改善OVA誘導哮喘小鼠模型氣道炎癥細胞的浸潤，抑制氣道上皮中杯狀細胞增生及黏液分泌，減少氣道下膠原沉積，同時，FSA可通過影響IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ等細胞因子水平而糾正哮喘小鼠模型的Th1/Th2失衡，并且其機制可能與p38 MAPK/NF-κB信號通路有關。