蒲公英提取物對吸入性肺損傷新生大鼠的保護作用①

張建鋒 時艷華 王獻紅 李建華 張洪杰 張玉蓉

(鄭州澍青醫學高等專科學校臨床醫學系內兒教研室,鄭州 450064)

胎糞吸入綜合征(Meconium aspiration syndrome，MAS)是一種嚴重的新生兒呼吸衰竭，由胎兒宮內氣喘或前幾次呼吸期間吸入胎糞引起的[1]。胎糞是新生兒的第一次大便，由羊水、黏液、膽汁、胎毛和皮膚及消化道細胞組成[2]。由胎糞引起的肺損傷是復雜的，可歸因于氣道的機械系阻塞、表面活性劑失活、化學性肺炎和肺動脈高壓[3]。根據吸入胎糞的時間和數量，胎糞可能導致部分或完全氣道阻塞，導致肺泡過度充氣或肺不張。被困氣體可能會引發肺泡破裂，導致空氣泄露綜合征，如肺間質性肺水腫、氣胸和肺炎支原體。盡管產科和新生兒護理有所改善，但其發病率和死亡率都很高，迫切需要更安全有效的治療選擇。蒲公英是一種菊科多年生草本植物，現代藥理研究表明蒲公英具有利膽、利尿、抗氧化、消炎和抗癌特性[4]。蒲公英的所有部分都可以用藥，尤其是富含多糖的根部，被廣泛用于臨床治療各種感染性和炎性疾病，如支氣管炎、肺炎、上呼吸道感染、肝炎等[5]。蒲公英提取物(Dandelion extract)是從傳統中藥蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)中提取而成，具有多種藥理作用。已有研究表明蒲公英提取物對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用[6]。本文旨在研究蒲公英提取物對胎糞誘導的吸入性肺損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 蒲公英全草(FCSPZYD7585)購自北京同仁堂；地塞米松(SD953F0)購自北京索萊寶科技有限公司;蘇木素-伊紅染液(D006-1-1)、Masson染液(D026-1-3)、髓過氧化物酶測試盒(A044-1-1)、丙二醛測定試劑盒(A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所;Anti-TNF-α(ab6671)、IL-6 ELISA Kit(ab100712)、IL-1β、IL-8(ab7747)和MCP-1(ab9669)ELISA Kit(ab100704)購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1蒲公英提取物制備[7]100 g蒲公英全草用紗布包裹，室溫下用水浸泡0.5 h，100℃加水提取3次：2 000 ml提取3 h，1 500 ml提取2 h，1 000 ml提取1 h。將3次提取液混合濃縮至100 ml，用0.22 μm注射器過濾器過濾并凍干，得到淡黃色粉末。

1.2.2動物模型的建立[8]及分組 40只SD大鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，雄性，1日齡。將大鼠用異氟烷(100 mg/kg)麻醉，置于手術臺，仰臥位，氣管切開后插入氣管導管，采用隨機數字表法將大鼠分為四組：空白對照組(Control)、模型組(Model)、地塞米松組(DEX)和蒲公英提取物組(Dandelion)。空白對照組通過導管緩慢注入生理鹽水(1.5 ml/kg)，其余3組大鼠均注入胎糞(1.5 ml/kg)，所有大鼠呼吸機機械通氣30 min，確保生理鹽水均勻進入支氣管及肺泡，縫合切口。地塞米松組靜脈注射地塞米松(0.5 mg/kg)，蒲公英提取物組靜脈注射蒲公英提取物(10.0 mg/kg)，空白對照組及模型組注射等量生理鹽水。12 h后所有大鼠放血至死，10%福爾馬林固定肺組織并進行石蠟包埋。

1.2.3肺濕干重比值 取各組大鼠左肺葉稱取濕重(W)，置于80℃烤箱烘烤24 h，稱量干重(D)，計算濕干重比值(W/D)。

1.2.4動脈血氣分析 分別于建立模型前1 h，建立模型后1、3、6、12 h采集大鼠動脈血，用血氣分析儀測定PaO2。

1.2.5HE染色 采用蘇木素-伊紅(H-E)染液，將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.6Masson染色 用蒸餾水潤濕玻片60 s，將組織用核染液染色60 s，棄去核染色液后用沖洗液沖洗30 s，漿染液染色60 s，棄去漿染液，沖洗液沖洗30 s，黃色分色液分色8 min，棄去分色液后直接用藍色復染液染色5 min，棄去藍色復染液，用無水乙醇沖洗干凈，吹干，無毒環保封固劑封片。在熒光顯微鏡下觀測。

1.2.7ELISA 在4℃下用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μl/孔加到96 孔酶標板，將抗原包被過夜，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150 μl 1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標儀測定。

1.2.8MPO、MDA 根據試劑盒說明書，用可見分光光度計測定大鼠血清中髓過氧化物酶(MPO)，肺組織髓過氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)活力,1 cm 光徑，蒸餾水調零，在460 nm處測MPO吸光度值，在532 nm處測MDA吸光度值。

2 結果

2.1蒲公英提取物減輕病理損傷 HE染色結果如圖1所示。Control組肺泡壁完好無增厚、無炎性浸潤、無充血。Model組大鼠肺組織表現明顯病理損傷、肺泡壁結構不完整、出血、水腫嚴重、炎癥細胞浸潤、肺組織實化。DEX組可見明顯肺泡壁增厚、輕度出血、水腫、廣泛炎癥細胞浸潤。Dandelion組肺泡壁輕微增厚、中度出血、水腫彌散性炎癥細胞浸潤;Masson染色顯示Control組大鼠肺組織未發生明顯纖維化。Model組大鼠肺組織大量區域被染為藍色，呈現高纖維化。DEX組大鼠肺組織部分區域被染為藍色。Dandelion組少量區域被染為藍色，纖維化程度低。

2.2蒲公英提取物下調PaO2水平 檢測大鼠動脈血氧分壓，結果如圖2所示：Model組PaO2水平12 h內呈下降趨勢極顯著低于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組PaO2水平極顯著高于Model組(P<0.01)。

2.3蒲公英提取物降低W/D比值 檢測各組大鼠肺濕干重比值(W/D)，如圖3所示：Control組W/D值顯著低于Model組(P<0.05)，DEX、Dandelion組W/D值顯著低于Model組(P<0.05)。

2.4血清炎癥因子水平 檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平，如表1所示：與Control組相比較，Model組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平顯著升高(P<0.01)，DEX、Dandelion組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1水平顯著低于Model組。

2.5肺泡灌洗液中炎癥因子水平 檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平，結果如表2所示：與Control組相比較，Model組TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平顯著升高(P<0.01)，Model組TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平極顯著高于DEX組(P<0.01)，Dandelion組TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MCP-1水平極顯著高于DEX組(P<0.01)。

2.6蒲公英提取物抑制MPO、MDA活力 檢測血清中MPO和肺MPO、MDA活力，如表3所示：Model組血清中MPO活力極顯著高于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組血清中MPO活力極顯著低于Model組(P<0.01)；Model組肺MPO活力極顯著高于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組肺MPO活力極顯著低于Model組(P<0.01)；Model組肺MDA活力極顯著高于Control組(P<0.01)，DEX、Dandelion組肺MDA活力極顯著低于Model組(P<0.01)。

圖1 肺組織病理損傷情況Fig.1 Pathological injury of lung tissue

圖2 動脈血氣分析Fig.2 Arterial blood gas analysisNote:*.P<0.05 vs control group；##.P<0.01 vs model group.

圖3 肺濕干重比值Fig.3 Ratio of wet to dry lung weightNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

表1 血清炎癥因子水平

Tab.1 Serum levels of inflammatory cytokines

GroupsSerum TNF-α(pg/ml)Serum IL-6(pg/ml)Serum IL-1β(pg/ml)Serum IL-8(pg/ml)Serum MCP-1(pg/ml)Control47.14±5.34 29.10±2.5147.15±4.25 98.08±5.2387.63±9.36 Model159.31±20.461)98.05±9.351)136.64±14.471)168.19±8.361)267.59±16.781)DEX55.61±4.542)36.32±3.862)63.84±5.532)118.84±4.372)129.71±11.252)Dandelion73.98±6.392)48.76±5.062)79.34±8.102)125.58±8.432)142.36±9.252)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

表2 BALF中炎癥因子水平

Tab.2 Levels of inflammatory cytokines in BALF

GroupsBALF TNF-α(pg/ml)BALF IL-6(pg/ml)BALF IL-1β(pg/ml)BALF IL-8(pg/ml)BALF MCP-1(pg/ml)Control27.36±6.98346.27±6.3136.29±3.8128.29±5.7449.38±7.31Model62.93±3.641)436.33±4.321)66.52±4.361)45.82±6.631)75.86±5.561)DEX43.26±2.622)360.52±3.812)42.33±5.642)32.41±5.192)65.76±6.632)Dandelion47.17±4.152)378.24±6.562)52.91±2.912)34.92±6.852)67.86±6.972)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

表3 檢測MPO,MDA活力

Tab.3 Detected MPO and MDA activity

GroupsSerumMPO(U/L)Lung MPO(U/g prot)Lung MDA(nmol/mg prot)Control141.35±18.340.53±0.060.89±0.12Model245.06±12.361)0.93±0.101)2.08±0.451)DEX123.66±13.402)0.61±0.062)0.91±0.092)Dandelion143.98±16.392)0.76±0.062)1.52±0.182)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.01 vs model group.

3 討論

胎糞吸入綜合征是新生兒肺損傷和呼吸衰竭的主要原因，發病率約為0.5%，死亡率在發展中國家居高不下[9]。胎糞可以趨化嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞，并通過肺微血管膜觸發其泄漏[10]。目前胎糞吸入綜合征的常規治療包括產時和產后口腔抽吸，然而這些技術并沒有降低胎糞吸入綜合征的發病率，在治療胎糞吸入綜合征的藥物，如抗生素、消炎藥、血管擴張劑等，只有吸入一氧化氮和表面活性劑才能減少胎糞吸入綜合征患兒體外膜肺氧合的需要[11]。因此，基于對胎糞吸入綜合征病理生理學的更好理解，發現療效好無副作用的藥物是重要的。

蒲公英是一種分布于世界各地的食用植物，屬于菊科，被認為是最耐受的藥用植物之一，幾乎沒有記錄的副作用。由于蒲公英含有植物性膽固醇，具有利尿和抗炎特性，長期以來一直在臨床上使用[12]。已有研究證明蒲公英提取物顯示出針對肺損傷的有利治療作用。Ma等[13]研究發現蒲公英水提取物通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對脂多糖誘導的急性肺損傷炎癥產生抗炎作用。Liu等[6]研究發現蒲公英提取物通過降低脂多糖誘導的肺MPO活性，增加SOD活性，減輕肺組織損傷。本文研究發現，蒲公英提取物具有升高胎糞誘導的吸入性肺損傷大鼠PaO2的水平，減輕肺組織病理損傷程度的作用。

水腫不僅是全身炎癥的典型癥狀，也是局部炎癥的典型癥狀，為了量化肺水腫的程度，我們評估了肺的W/D比值。在此，我們發現蒲公英提取物能降低肺的W/D比值，說明蒲公英提取物能抑制漿液向肺組織滲漏，減輕肺水腫的發生。

胎糞誘導的肺部炎癥在胎糞吸入綜合征的發病機制中起著重要作用，蒲公英長期用于治療包括炎癥在內的人類疾病，這種抗炎作用可能是通過減少一氧化氮、前列腺素、TNF-α、IL-1β、IL-6和環氧合酶(COX)-2對巨噬細胞的作用產生的[14]。胎糞在肺內發生炎癥反應，引發肺毛細血管炎性滲出，炎性細胞參與其中并釋放相關炎性介質，從而對細胞造成損傷，導致肺損傷[15]。Berdeli等[16]研究發現胎糞通過大鼠肺泡巨噬細胞增加IL-6和TNF-α的產生。Han等[17]研究發現蒲公英提取物通過降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表達可預防結腸炎。本文研究發現，蒲公英提取物具有降低血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1表達的作用，從而降低肺部炎癥。說明蒲公英提取物通過調節炎癥因子改善大鼠吸入性肺損傷。

MPO是中性粒細胞的嗜天青顆粒所釋放的過氧化物酶，MPO活性反映了肺中性粒細胞的附著和邊緣化[18]。中性粒細胞在細胞外培養基中排泄MPO，導致HOCI和其他幾種活性氧衍生物的積累，并導致蛋白質或細胞結構的氧化修飾[19]。MDA是脂質過氧化反應的最終產物，并在一定程度上顯示出了氧化應激的水平[20]。Lu等[21]研究發現蒲公英提取物通過降低肺MPO、MDA活性減輕胎糞誘導的吸入性肺損傷。Li等[22]研究發現蒲公英提取物可通過降低MDA活性抑制三陰性乳腺癌細胞凋亡。本文研究發現，吸入性肺損傷新生大鼠肺MDA活力升高，表明吸入胎糞破壞肺組織細胞膜結構，而加入蒲公英提取物后，MDA活力降低，表明蒲公英提取物具有抗氧化作用，且蒲公英提取物極顯著降低大鼠血清MPO及肺MPO活性，表明蒲公英提取物可以抑制胎糞誘導的吸入性肺損傷發展過程中中性粒細胞的作用和浸潤。

總的來說，本研究揭示了蒲公英提取物對吸入性肺損傷新生大鼠的保護作用：減輕肺組織病理損傷程度，升高PaO2水平，降低肺的W/D比值，降低血清和肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和MCP-1的表達，降低大鼠血清MPO活性及肺MPO、MDA活性。本研究結果闡明了蒲公英提取物具有治療胎糞吸入綜合征的潛力，下一步計劃針對蒲公英提取物改善胎糞吸入綜合征的作用機制及合適的給藥方案與是否存在不良反應作進一步研究。