具有抗氧化功能的副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M9-1的安全性初步評價

王英，范琳琳，施亞萍，李亞輝，王帆，周劍忠

（1.江蘇省農業科學研究院農產品加工研究所南京210014；2.南京市脆而爽蔬菜食品有限公司南京211225）

0 引 言

乳酸菌主要來源于傳統發酵食品（乳制品、開菲爾、發酵茶、發酵肉、泡菜等），也是腸道微生物的重要菌群。研究表明，乳酸菌具有多種功能作用，在機體的氧化應激、膽固醇降解、免疫力調節、炎癥抵抗、腸道菌群的平衡調節和病原菌抑制等方面發揮著重要作用[1-2]。

乳酸菌對發酵制品的風味、感官、質地等方面也發揮這個重要作用[3]。但是也有研究結果顯示，有些乳酸菌具有抗生素抗性，甚至出現了多重耐藥性[4]。而經過乳酸菌發酵的產品和益生菌制劑一般不再經過二次消毒即可直接食用，如果乳酸菌含有可轉移的抗藥基因，就可能作為傳播的媒介將抗性基因轉移給其他腸道細菌，進而對人體健康造成危害。

目前我國沒有相關乳酸菌安全性評價的相關準則，但乳酸菌菌株是否有毒性及有害代謝產物檢測、耐藥性檢測、對機體的內在影響等研究也是必不可少的。副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1來源于傳統自然發酵奶食品，具有優良的體外和體內抗氧化能力、發酵性能和抗逆能力,具有潛在的應用價值和前景[5-6]。本研究對兩菌株進行耐藥性實驗、機體指標和有害代謝產物的評價實驗以及急性毒理實驗，利用體外實驗評價這兩株菌的安全性，為其以后的開發和應用提供理論的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與小鼠

副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1由江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品工程研究室保存。

實驗動物采用SPF(Specific pathogen-free)級昆明種小鼠，雄性ICR（Institute of Cancer Research），體重20±2 g，由揚州大學動物中心提供（Scxk蘇2012-0004）。實驗動物普通飼料由青龍山飼料物廠提供。

儀器與試劑：UV-1600PC紫外分光光度計，上海美普達科技有限公司；DYCP-電泳儀，北京六一儀器公司；GIS3500凝膠成像儀，上海天能儀器有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；SIGMA3K-15臺式冷凍離心機，北京五洲東方科技發展有限公司；124S-CW分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TOMY SX 500自動滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司。

質粒小量提取試劑盒(DP103)，購自Qiagen公司；藥敏紙片（鏈霉素、氨芐西林、萬古霉素、四環素、氯霉素、慶大霉素、利福平、多粘菌素、青霉素G、環丙沙星和紅霉素），購于杭州濱和微生物試劑有限公司；胰酶、膽鹽、L-酪氨酸二鈉鹽、L-組氨酸鹽酸鹽、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-賴氨酸鹽酸購自阿拉丁；血平板購自南京便診生物科技有限公司；其他所用化學試劑均為分析純級化學試劑，購自南京卓越生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠飼養

小鼠適應一周后，稱重，然后隨機分成3組（每組10只）。將小鼠同室分籠喂養，采用自然光照，自由采食和飲水。飼養環境溫度25±2℃，相對濕度60%。

1.2.2 FM-M 9-1和FM-LP-4培養及菌體處理

無菌條件下，從新鮮培養的FM-M 9-1和FM-LP-4的平板上挑取單菌落至MRS液體試管中，37℃條件下靜止培養18～20 h至穩定初期，按3%的接種量轉接到含有150 mL MRS液體培養基的三角瓶中培養18 h，上述培養好的菌液5 000 r/m離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗2次后重懸菌體，調整菌體密度（5.01±0.05）×109CFU/mL，備用。

1.2.3 急性毒理實驗

將經過適應性喂養的清潔級昆明雄性小鼠隨機分成3組，每組10只。分別編號為FM-M 9-1實驗組、FM-LP-4實驗組和對照組。將制備好的菌液按每只0.2 mL/10 g體重的劑量進行灌胃，一日3次，每次間隔3 h。對照組灌胃相同量的生理鹽水。觀察7日內小鼠的活動狀態，灌胃結束后稱重并用頸椎脫臼法處死小鼠，計算小鼠的肝臟系數和腎臟系數。

1.2.4 FM-M 9-1和FM-LP-4的藥敏性測定

耐藥性試驗：采用藥敏紙片擴散法行藥敏試驗，本實驗中選取常見的11種藥敏紙片，包括鏈霉素、氨芐西林、萬古霉素、四環素、氯霉素、慶大霉素、利福平、多粘菌素、青霉素G、環丙沙星和紅霉素。以大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質控標準菌。取100μL FM-M 9-1和FM-LP-4菌液分別涂布于MRS固體培養基平板上，待菌液被培養基完全吸收后，將藥敏紙片放于培養基上，靜置20 min后，倒置放于37℃培養箱中培養20 h后，測量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。

1.2.5 FM-M 9-1和FM-LP-4質粒提取

取1.5 m L培養好的菌液，使用TIANGEN質粒小提試劑盒(DP103)提取質粒。提取步驟參照說明書。在菌體破壁處理步驟中，加入溶菌酶。提取樣品用瓊脂糖凝膠電泳檢測，以含有PMG36e質粒的乳酸乳球菌1363為陽性對照。

1.2.6 FM-M 9-1和FM-LP-4生物膜性能測定

菌株的形成生物膜的能力測定的方法參照文獻[7]進行，稍作修改，具體方法如下：分別挑取新鮮培養的FM-M 9-1和FM-LP-4的單菌落接種到含有0.25%（m/m）葡萄糖的MRS液體培養基中，30℃條件下培養18～20 h，然后用質量分數0.25%葡萄糖的MRS液體培養基稀釋20倍，之后取200μL接種到無菌的96孔板中，37℃條件下培養24 h，用無菌的PBS（p H 7.2～7.4）緩沖液沖洗96孔板，倒置干燥后用1%的結晶紫染色15 min，再次用PBS緩沖液沖洗后加入甲醇和乙醇混合液（80∶20，體積比）溶解，在595 nm條件下測定吸光值。生物膜形成能力采用下面的表示方法表示，吸光值小于1，無成膜能力，吸光值介于1～2之間，成膜能力弱，吸光值在2～3之間，成膜能力中等，吸光值大于3，成膜能力強。

1.2.7 FM-M 9-1和FM-LP-4溶血特性測定

菌株的溶血特性實驗的方法參照文獻[8]進行，稍作修改。具體方法如下，分別從培養48 h的平板上挑取FM-M 9-1和FM-LP-4單菌落無菌條件下劃線接種于含有7%羊血的血平板上，以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為對照，其中金黃色葡萄球菌為β-型，表皮葡萄球菌為γ-型。37℃培養72 h觀察溶血圈，菌落周圍沒有明顯變化，其溶血型為γ-型，參照表皮葡萄球菌的溶血現象；在菌落周圍有明顯的溶血圈的為β-型，參照金黃色葡萄球菌的溶血現象；菌落周圍呈現墨綠色為α-型。

1.2.8 FM-M 9-1和FM-LP-4產生物胺性能測定

檢測菌株FM-M 9-1和FM-LP-4產生物胺的方法參照文獻[9]進行，稍作修改。具體操作方法如下：將FM-M 9-1和FM-LP-4接種至分別含有0.1%（質量分數差）的氨基酸前體（L-酪氨酸二鈉鹽、L-組氨酸鹽酸鹽、L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-賴氨酸鹽酸鹽）的MRS液體培養基中，連續培養10次，以誘導產生脫羧酶。誘導結束后，將菌株在分別含有1%的氨基酸（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸）的脫羧酶培養基上，以不含氨基酸的脫羧酶培養基作為對照，平板在37℃條件下培養4 d，菌體周圍顏色變紫的菌株具有脫羧酶活性，顏色與不含氨基酸的脫羧酶培養基上相同的菌株不具有脫羧酶活性。

1.2.9 FM-M 9-1和FM-LP-4有害代謝產物評價試驗

1.2.9.1 吲哚實驗。

將活化好的FM-M 9-1和FM-LP-4菌株按2%的接菌量分別接入到蛋白胨水培養基中。37℃培養72 h，加入吲哚試劑8～10滴，觀察實驗結果。同時做空白實驗。

1.2.9.2 硝酸鹽還原酶活性檢測。

將活化好的FM-M 9-1和FM-LP-4菌株按2%的接菌量分別接入到硝酸鹽培養基中37℃培養5 d后，滴加碘化鉀和淀粉溶液各10滴，觀察實驗結果。同時做空白實驗。

1.2.9.3 產偶氮還原酶能力的測定。

將過夜活化的FM-M 9-1和FM-LP-4菌液涂布于含有5 mg/L直接藍71的MRS固體培養基上，置于37℃培養72 h，觀察水解圈的產生情況。

1.3 數據分析

實驗重復3次，實驗結果采用 SPSS 13.0和One-Way（ANOVA）進行統計和顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 急性毒理實驗

灌胃的7 d內，小鼠的進食、飲水和活動正常，無異常行為，皮毛正常。體重結果顯示，實驗組的小鼠體重正常，與對照組無顯著差異性（見表1）。實驗組小鼠的肝臟器系數和腎臟器系數與對照組相比沒有明顯差異（P＞0.05）。

表1 體重和臟器系數（肝和腎）

2.2 耐藥性評價試驗

隨著乳酸菌安全性研究成為關注的熱點，乳酸菌對抗生素抗性的研究逐漸增多。本試驗測定了FM-M 9-1和FM-LP-4菌株對11種抗生素的敏感性，結果顯示：FM-M 9-1和FM-LP-4菌株都對萬古霉素、慶大霉素和多粘菌素具有抗性，對其他抗生素都具不同程度的有敏感性，具體結果見表2。

2.3 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4質粒提取

腸球菌的抗藥基因是乳酸菌抗藥性的研究熱點，例如紅霉素、萬古霉素、四環素、氯霉素和慶大霉素耐藥相關的基因，這些基因位于可轉移性遺傳物質上[10]。本研究利用提取試劑盒提取菌株FM-M 9-1和FM-LP-4的質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳做質粒檢測，檢測結果顯示兩菌株所在泳道均未出現熒光條帶(見圖 1)，可以認定FM-M 9-1和FM-LP-4不含有耐藥質粒。耐藥基因可能存在于細菌DNA上，即不攜帶有可轉移的耐藥基因。

表2 FM-M9-1和FM-LP-4藥敏試驗結果

圖1 質粒提取試驗結果

2.4 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4的溶血特性分析

溶血現象的發生可能是由于溶血性細菌侵入引起的，嚴重時導致敗血癥的發生。不具有溶血活性是乳酸菌作為安全菌株篩選和使用的一個重要條件[11]。本研究對FM-M 9-1和FM-LP-4的溶血活性進行了研究，研究結果顯示，FM-M 9-1和FM-LP-4在7%羊血平板上，37℃培養72 h后長出菌落的周圍沒有明顯變化，說明這兩株菌溶血型為γ-型，不具有溶血活性。Maragkoudakis等對干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的溶血特性研究結果顯示，菌株大部分是γ-型，少部分是a-型[12]。

2.5 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4的生物胺產生能力

正常量的生物胺具有重要的生理作用，是激素、核酸、生物堿等物質的前體，具有維持免疫系統代謝活性和正常的內臟功能，但當超過一定的量就會對人體產生毒副作用[13]。2011年10月歐盟食品安全局（EFSA）發布關于“發酵食品中生物胺”的科學意見，認為組胺和酪胺是最具毒性。另外，生物胺之間的毒性具有協同增加作用。二胺和多胺會抑制單胺的代謝，進而使毒性增強。脫羧酶是生物胺形成過程中的主要酶，因此，檢測乳酸菌中是否具有氨基酸脫羧酶活性是乳酸菌應用的一個主要指標。本實驗中對FM-M 9-1和FM-LP-4的脫羧酶活性進行檢測。檢測結果顯示，平板在37℃條件下培養4 d，FM-M 9-1和FM-LP-4菌體周圍與不含氨基酸的脫羧酶培養基上相同，表明菌株FM-M 9-1和FM-LP-4沒有本研究內容中所包含的4種脫羧酶活性。

2.6 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4形成生物膜能力

在食品工業中，從衛生和安全的角度來看，菌株成膜是不利因素。因為成膜可以導致食品污染，同時成膜給病原微生物粘附到食品表面提供有利條件。有研究對乳酸菌一些菌株的形成生物膜的能力及相關的功能基因進行報道[14]。本研究中的FM-M 9-1和FM-LP-4的成膜結果顯示，兩株菌的595 nm的值小于1，無形成生物膜的能力。

2.7 菌株FM-M 9-1和FM-LP-4有毒代謝產物檢測

本研究測定了FM-M 9-1和FM-LP-4菌株的有毒代謝產物吲哚類物質、硝酸鹽還原酶和產偶氮還原酶能力（見表3）。吲哚實驗可以檢測菌株是否能分解蛋白質中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質合成、調節免疫功能和促進消化。色氨酸代謝過程發生障礙會引起肝功能衰退、惡性腫瘤等[15]。從表中可以看出，FM-M 9-1和FM-LP-4的代謝產物中沒有吲哚類物質。硝酸鹽還原酶可以將食物中含有的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是強致癌物亞硝胺的前體物質，與食品中蛋白質分解中間產物仲胺反應形成亞硝胺，后者可誘發多種癌癥如肝癌、胃癌、食道癌和咽癌等[16]，從表中可以看出，FM-M 9-1和FM-LP-4菌株都不含有硝酸還原酶或硝酸還原酶無活性。部分乳酸菌代謝產物中含有偶氮還原酶，能夠催化偶氮鍵（R 1-N=N-R 2）斷裂。研究結果顯示，機體內微生物代謝產物偶氮還原酶也能還原成某些物質為致突變劑或致癌物質[17]。研究結果顯示，FM-M 9-1和FM-LP-4菌株都不含有偶氮還原酶或偶氮還原酶無活性。

表3 FM-M 9-1和FM-LP-4有毒代謝產物試驗結果

3 結果與討論

隨著對乳酸菌研究的深入，發掘出越來越多的功能特性。目前乳酸菌除了應用到發酵食品中，在微生態益生制劑中的應用也越來越多廣泛。雖然大量文獻證明，大多數乳酸菌菌株或使用乳酸菌進行食品發酵是安全可行的，但也有少量研究結果顯示能夠從一些患者體內分離出乳酸菌，可能與尿道感染、心內膜炎等疾病有關[18]。因此，對新篩選出的擬作為食品發酵劑或益生菌劑的乳酸菌進行安全性評價是十分必要的，尤其是用于食品的菌株[19]。乳酸菌的耐藥性是目前乳酸菌安全性評價中關注的一個內容，研究結果顯示有些乳酸菌對氨基糖苷類、萘啶酸類、萬古霉素類、頭孢霉素類等抗生素藥品有抗性[20]。乳酸菌本身具有的一些固有抗性是有益的，能夠作為益生菌劑在腸道菌群調節中發揮作用。但是攜帶質粒的具有抗藥性的乳酸菌，有可能作為傳播媒介把抗性基因轉移給其他腸道細菌，導致超級細菌的產生，進而對人體健康造成危害[4]。但本實驗中副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1菌株具有萬古霉素、慶大霉素和多粘菌素抗性，但沒有提取耐藥質粒。該研究中菌株的抗藥性選擇了一些常規的抗生素測定其抗性，對其他的抗生素是否具有抗性在后續的研究中需要繼續。

副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1是來源于新疆傳統發酵駱駝奶的兩株乳酸菌，均具有優良的抗氧化功能，具有良好的加工穩定性[5-6]。本研究對副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1安全性進行初步評價，結果顯示這兩株菌均不具有硝酸鹽還原酶活性、偶氮還原酶活性和氨基酸脫羧酶活性（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸）。形成生物膜能力都比較弱。為了提供更加全面的安全性指標，對菌株的抗藥性基因和有毒基因的檢測仍需要繼續研究。另外，利用動物體內實驗評價副干酪乳桿菌FM-LP-4和干酪乳桿菌FM-M 9-1的安全性也是后續的研究重點。