QuEChERS/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑

楊明，伊鋆，胡筱靜，董秋花，許晴，李首道，盧躍鵬，江小明，涂鳳琴

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所武漢430012）

0 引言

β-受體激動(dòng)劑屬于腎上腺類合成藥物，它具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)[1-2]，對支氣管哮喘、痙攣和高血壓等癥狀均有較好的效果。其能夠擴(kuò)張平滑肌，進(jìn)而提高肺活量，同時(shí)也可以調(diào)控胰島素從而加速分解體內(nèi)糖類和脂類。然而在動(dòng)物飼料中添加此類藥物，可以明顯提升動(dòng)物的廋肉率。但是食品中殘留的瘦肉精會(huì)對人體造成嚴(yán)重的危害，會(huì)出現(xiàn)中毒、引發(fā)惡性腫瘤，甚至是導(dǎo)致死亡等[3-4]。在2002年，我國已將β-受體激動(dòng)劑列入《食用動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》[5]，然而在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，依然存在β-受體激動(dòng)劑非法濫用的情況。嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒生長期不可或缺的營養(yǎng)食品，其β-受體激動(dòng)劑殘留將會(huì)給嬰幼兒的正常發(fā)育和健康成長帶來巨大的傷害。因此，建立嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑分析方法對于監(jiān)控嬰幼兒配方奶粉中β-受體激動(dòng)劑殘留情況，以保障嬰幼兒食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前動(dòng)物源食品中β-受體激動(dòng)劑類藥物的測定方法主要有毛細(xì)管電泳法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[7]、液相色譜法(HPLC)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[10]等。毛細(xì)管電泳法操作簡便，但分離能力較弱，穩(wěn)定性差，重現(xiàn)性不好。酶聯(lián)免疫吸附法快速簡單，但易出現(xiàn)假陽性。GC-MS法通常需要衍生化處理，操作繁瑣。HPLC法分離效果較好，但是定性能力和特異性較差；HPLC法定性能力較弱，特異性較差；HPLC-MS/MS法具有高靈敏度、高選擇性和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，已在動(dòng)物源類食品分析中得到廣泛的應(yīng)用。在前處理技術(shù)方面，傳統(tǒng)的前處理技術(shù)存在有機(jī)溶劑使用量大、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe）技術(shù)其具有操作簡單、便捷高效、溶劑用量小等特點(diǎn)，近年來在獸藥殘留檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-12]。目前關(guān)于嬰幼兒配方奶粉中β-受體激動(dòng)劑測定的方法少見報(bào)道。本研究結(jié)合了QuECh-ERS技術(shù)的操作快速簡便和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn)，建立了QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（QuEChERS-HPLC-MS/MS）同時(shí)檢測嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留的分析方法。方法操作簡便、分析速度快、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，能夠?yàn)閶胗變号浞侥谭壑?4種β-受體激動(dòng)劑殘留狀況的監(jiān)測提供有力的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

SCIEX4500TripleQuad質(zhì)譜儀(配有可用于電噴霧電離的TurboV離子源），美國ABSCIEX公司；LC30A液相色譜儀，日本島津公司；AllegraX-15R Centrifuge離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器，美國ScientificIndustries公司；PM5-2000TL超聲波清洗器，普律瑪儀器公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；ME204/02電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，英國Genevac公司。

克倫特羅（CAS：37148-27-9）、沙丁胺醇（CAS：18559-94-9）、萊克多巴胺（CAS：90274-24-1）、特布特林（CAS：23031-32-5）、西馬特羅（CAS：54239-37-1）、噴 布 特 羅（CAS：38363-32-5）、妥 布 特 羅（CAS：41570-61-0）、馬布特羅（CAS：54240-36-7）、馬噴特羅（CAS：95656-68-1）、溴氯布特羅（CAS：37153-52-9）、溴布特羅（CAS：41937-02-4）、羥甲基克倫特羅（CAS：

37162-89-3）、塞布特羅（CAS：54239-37-1）、鹽酸苯氧丙酚胺（CAS：579-56-6）均為FirstStandard品牌標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥97.0%），天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙酸銨（均為色譜純），德國Merck公司；甲酸、氨水（均為色譜純），美國Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、氨基（NH2）吸附劑、中性氧化鋁(Al2O3-N)、弗羅里硅土（Florisil）和氧化鋯（Zirconia），上海安譜科學(xué)儀器公司；乙酸銨、氯化鈉（NaCl）、硫酸鎂（MgSO4）和硫酸鈉（Na2SO4），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水（18.2MΩ·cm）由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量14種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制質(zhì)量濃度約為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18°C保存。臨用時(shí)用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品前處理

嬰幼兒配方奶粉充分混勻，準(zhǔn)確稱取1g（精確至0.0001）試樣置于50mL具塞塑料離心管中，加入5.0mL2mol/L乙酸銨緩沖液，50μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋使奶粉充分溶解，37℃酶解12h，然后再加入10mL5.0%氨水乙腈，渦旋混勻，超聲提取30min，加入3gNaCl+3gNa2SO4，渦旋振蕩,以4750r/min冷凍離心5min。取全部上清液置于含100mgPSA吸附劑的15mL具塞離心管中，渦旋振蕩2min，4750r/min離心5min，取5mL上清液于試管中，40℃旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用1.0mL乙腈-0.1%甲酸水（1+9，體積比）復(fù)溶，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，供HPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相A：5mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～1.5min，5.0%B；1.5～4.0min，5.0%～40.0%B；4.0～6.0min，40.0%～90.0%B；6.0～9.0min，90.0%B；9.0～9.01min，90.0%～5.0%B；9.01～12.0min，5.0%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離源：ESI正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；電噴霧電壓(IS)：4500V；霧化氣(GS1)：50.0psi；輔助氣流速(GS2)：50psi；氣簾氣壓力(CUR)：35psi；碰撞氣體(CAD)：Medium；離子源溫度(TEM)：500℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用針泵進(jìn)樣將兩種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。分別采用ESI+和ESI-模式對14種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行母離子全掃描，結(jié)果表明14種β-受體激動(dòng)劑在ESI+和ESI-模式下均有較高的質(zhì)譜響應(yīng)，在ESI+模式下信號穩(wěn)定性較好。因此優(yōu)先選擇ESI+掃描模式，在該模式下兩種化合物均產(chǎn)生[M+H]+的母離子。對兩種化合物進(jìn)行二級碎片離子掃描，選擇響應(yīng)較高、干擾小的兩個(gè)碎片離子用于定性定量分析，其中響應(yīng)最高的碎片離子用于定量分析，同時(shí)優(yōu)化各目標(biāo)化合物的去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等質(zhì)譜參數(shù)。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件如表1所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選擇WatersXBridgeC18(150mm×2.1mm,5μm)色譜柱對14種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行分離分析。采用ESI+模式，比較了14種β-受體激動(dòng)劑在乙腈-水與甲醇-水流動(dòng)相體系中的色譜行為，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在乙腈-水流動(dòng)相體系中分離度較好。在流動(dòng)相中加入適量的酸和乙酸銨可以提高分析物的離子響應(yīng)和分離度，從而達(dá)到足夠的靈敏度。因此，本研究進(jìn)一步考察在流動(dòng)相體系中添加不同含量的甲酸、乙酸銨對目標(biāo)物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，以5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)高、保留穩(wěn)定且峰形好。因此，本實(shí)驗(yàn)采用5 mmol/L乙酸銨/0.1%甲酸水-乙腈作為流動(dòng)相。

表1 14種β-受體激動(dòng)劑的母離子、子離子等重要質(zhì)譜參數(shù)

2.3 提取試劑優(yōu)化

14種化合物具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核[13]，極性強(qiáng)，易溶于乙腈、甲醇和乙酸乙酯等溶劑，本實(shí)驗(yàn)選用乙腈、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑并比較其提取效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇提取液的水分較多且顏色較深，不僅會(huì)干擾目標(biāo)物的分析、損害色譜柱、污染質(zhì)譜離子源；乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重；嬰幼兒配方奶粉中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂類，而乙腈具有很好的沉淀蛋白作用[14]，且各化合物的提取回收率均優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑，同時(shí)進(jìn)一步考察比較了添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和6%氨水的乙腈提取情況，測定結(jié)果以3次平行測定的平均值表示。結(jié)果表明：14種目標(biāo)化合物在0.5%、1%、2%三種氨水乙腈提取溶劑中平均回收率相差不大，分別為72.61%、72.14%、71.66%，且略低于3%、4%、6%三種氨水乙腈的平均回收率，分別為77.06%、81.06%、79.87%。相比之下5%氨水乙腈作為提取溶劑時(shí)的平均回收率最高，為93.30%，特別是沙丁胺醇的回收率大大高于其它5種，且各目標(biāo)物的回收率均在80%～110%之間，完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此本實(shí)驗(yàn)采用5%氨水乙腈作為提取溶劑。不同提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響如圖1所示。

圖1 不同提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響

2.4 吸附劑的選擇

嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)中富含蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等多種有機(jī)成分，可能會(huì)對目標(biāo)化合物的測定造成干擾。本實(shí)驗(yàn)考察了含量均為100 mg的PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、NH2吸附劑、中性氧化鋁（Al2O3-N）和弗羅里硅土（Florisil）和氧化鋯（Zirconia）等QuECh-ERS方法常用凈化劑對目標(biāo)化合物的凈化效果和回收率情況，測定結(jié)果以3次平行測定的平均值表示。結(jié)果表明（如圖2所示），NH2吸附劑和Al2O3-N作為吸附劑時(shí)各目標(biāo)化合物的平均回收率分別為79.81%和76.61%，均在70%～80%之間；PSA、C18、GCB、Florisil和Zirconia作為吸附劑時(shí)各目標(biāo)化合物平均回收率分別為83.45%、84.72%、85.84%、83.88%和80.35%，均優(yōu)于NH2吸附劑和Al2O3-N，且噴布特羅在PSA吸附劑條件下的回收率為70.93%，而在其它6種吸附劑條件下回收率均低于60%，表明這六種吸附劑對噴布特羅具有一定程度的吸附。故本實(shí)驗(yàn)最終選用100 mg PSA吸附劑對樣品提取液進(jìn)行凈化。

圖2 不同凈化劑對目標(biāo)物回收率的影響

2.5 鹽析劑的優(yōu)化

NaCl、MgSO4和Na2SO4是常用的鹽析劑，嬰幼兒配方奶粉樣品經(jīng)過酶解后的水分含量較高，需要加入合適的鹽析劑使在用5%氨水乙腈提取時(shí)出現(xiàn)有機(jī)相和水相分層，以達(dá)到除水的目的。本實(shí)驗(yàn)考察了6 g NaCl、6 g MgSO4、6 g Na2SO4、3 g NaCl+3 g MgSO4、3 g NaCl+3 g Na2SO4、3 g MgSO4+3 g Na2SO46種鹽析劑對目標(biāo)化合物回收率的影響，測定結(jié)果以3次平行測定的平均值表示。結(jié)果表明（如圖3所示），Mg-SO4、NaCl+MgSO4、MgSO4+Na2SO4三種鹽析劑分別為52.71%、78.71%、60.85%，各目標(biāo)化合物平均回收率偏低，可能原因是目標(biāo)物與Mg2+發(fā)生螯合反應(yīng)；Na2SO4作為鹽析劑時(shí)目標(biāo)化合物的平均回收率為53.14%，完全不滿足實(shí)驗(yàn)要求；而NaCl和NaCl+Na2SO4這兩種作為鹽析劑時(shí)平均回收率分別為83.29%和90.59%，很明顯NaCl+Na2SO4作為鹽析劑時(shí)效果優(yōu)于NaCl。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，選擇3 g NaCl+3 g Na2SO4作為鹽析劑。

圖3 不同鹽析劑對目標(biāo)物回收率的影響

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect,ME）是指目標(biāo)化合物在離子化時(shí)受到樣品基質(zhì)中的某些組分的干擾而引起的分析信號變化，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)可通過比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評價(jià)[15]。計(jì)算公式：ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME為0.85-1.15時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；當(dāng)ME＞1.15時(shí)，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0.85時(shí)，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)對14種β-受體激動(dòng)劑的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明，羥甲基克倫特羅（ME=0.84）基質(zhì)效應(yīng)＜0.85，存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其它13種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在0.85～1.15之間。為使定量分析結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，故本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作校準(zhǔn)曲線來降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響。

2.7 方法學(xué)考察

用空白基質(zhì)提取液配制系列濃度的14種β-受體激動(dòng)劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在各優(yōu)化條件下分析測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，14種目標(biāo)化合物在0.5～58.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9990。以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限（LOQ），目標(biāo)化合物的檢出限均為0.12～0.52μg/kg，定量限為0.40～1.73μg/kg。選取陰性樣品添加3個(gè)濃度水平(2.0、10.0、40.0μg/kg)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行樣，以考察方法的回收率和精密度。結(jié)果見表2，14種目標(biāo)化合物的平均回收率為70.69%～98.54%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.59%～9.24%，方法回收率高、精密度高，滿足嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑殘留監(jiān)測的要求。

表2 分析物的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.8 實(shí)際樣品測定

采用本方法對從市場上隨機(jī)抽取的56批次嬰幼兒配方奶粉（28批次Ⅰ段，14批次Ⅱ段，14批次Ⅲ段）進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，所測嬰幼兒配方奶粉中均未檢出這14種β-受體激動(dòng)劑。

3 結(jié)論

本研究以5%氨水乙腈為提取溶劑，采用QuECh-ERS前處理技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，建立了快速測定嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑的分析方法。方法簡單快速、操作簡便、靈敏可靠，并成功用于實(shí)際樣品的測定，可作為嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑的定性定量檢測手段，對于嬰幼兒配方奶粉中14種β-受體激動(dòng)劑殘留情況的監(jiān)測具有重要的應(yīng)用價(jià)值。