動物深靜脈血栓形成前后的實驗性研究進展

朱 聰,畢 衡

(1.云南中醫藥大學,云南 昆明650000;2.云南省中醫醫院,云南 昆明650000)

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)是血液在深靜脈內異常凝結為血栓引起的靜脈回流障礙性疾病。若血栓脫落則可引起肺動脈栓塞(pulmonary embolism,PE),DVT與PE統稱為靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE),是同種疾病在不同階段的表現,多見于近期有嚴重創傷或大手術后、肢體制動或腫瘤患者[1]。影響DVT的三大因素為靜脈壁損傷、靜脈血流滯緩和血液高凝狀態[2]。由于醫學倫理的關系,該項研究僅在實驗動物中開展,因此國內外學者利用兔、犬、大鼠、小鼠等實驗動物制備具有針對性的DVT模型,雖然其研究各有側重,但都未曾脫離對上述DVT因素的基礎研究。本文對近年來關于DVT動物實驗性研究進行綜述,以便為臨床科研工作者提供參考。

1 靜脈壁損傷的研究進展

靜脈壁由外膜、中層和內膜組成。當內膜損傷時,內皮細胞缺損、脫落,此時機體局部血細胞聚集、血小板黏附,最終形成血栓。通過了解DVT與內皮細胞損傷的相互關系,建立相對應的靜脈內膜損傷后血栓動物模型,以此研究針對內皮細胞的輔助藥物,并分析其特異性代謝方式,是目前靜脈壁損傷的主要研究模式。

王兵等[3]將120只新西蘭大白兔隨機分為創傷固定組、骨折固定組、單純固定組及空白對照組,光學顯微鏡下觀察不同時相點白兔股靜脈血栓形成及靜脈壁損傷情況,結果顯示,第7日創傷固定組血栓發生率為80%,伴有靜脈內膜損傷、內皮細胞剝脫,發現白兔創傷性DVT與靜脈內膜內皮細胞損傷密切相關。司春強[4]將55只家兔隨機分為正常組5只,血栓組、假手術組各25只,于實驗后半日及1、2、4、7 d取實驗段血管,采用透射電子顯微鏡觀察內皮細胞凋亡情況,發現在家兔急性DVT后的1～2 d內,內皮細胞凋亡達到峰值,然后呈下降趨勢,借此反向證實DVT與靜脈壁的關系。范春芝等[5]在此基礎上,選取24只雄性比格犬,以比格犬左下肢股靜脈為對照側,右下肢股靜脈為實驗側,采用二維超聲心動圖測量靜脈管腔直徑與彩色多普勒超聲定位相結合,在超聲引導下,通過毛刷破壞靜脈內膜的方式成功構建了比格犬下肢DVT的實驗模型,該法操作簡易、創傷低、血栓形成率較高。在動物模型飛速發展的背景下,王護國等[6]將96只大鼠制備成急性DVT模型后,按血栓形成的階段分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期,每期再均分為小劑量組[尿激酶2萬U/(kg·d)]、中劑量組[尿激酶4萬 U/(kg·d)]、大劑量組[尿激酶8萬U/(kg·d)]和模型組,實驗中連續7 d每日于大鼠尾靜脈注射尿激酶,通過HE、苦味酸-天狼猩紅染色觀察各組血管內皮細胞數量和膠原含量的改變,發現在血栓形成14 d內,尿激酶保護受累血管的內皮細胞而抑制膠原增生,在血栓形成14 d后,尿激酶對受累血管的內皮細胞無保護而對膠原增生仍有抑制作用,這給DVT的治療提供了有效的參考依據。有學者證明了DVT的代謝失調主要集中在能量代謝、鞘脂和腺苷代謝[7],說明小鼠實驗模型中DVT特異性代謝產物的特征,為針對靜脈壁的DVT提供了新的研究方向。

2 靜脈血流滯緩的研究進展

血流是針對血管內血液的流動而言,其動力是心臟搏動時所產生的壓力,當血流量受到血管系統的阻力、血液量等各種因素的影響,均可導致血流緩滯,進而導致血栓的形成。針對靜脈血流淤滯這一特征,研究人員通過對血流動力學的研究并分析其變化的影響因素,建立了新的動物DVT模型。

SHIFRI E C等[8]最早提出了DVT中緩慢與急性股靜脈阻塞的血流動力學理念,實驗中通過使用一個緩慢和漸進的股靜脈阻塞模型,發現DVT存在血流動力學作為基礎的可能性。為了進一步研究并觀測血流變化,韓力群等[9]建立了犬DVT的動物模型,并用彩色多普勒超聲連續動態監測血栓形成早期的超聲動態聲像圖及血流動力學變化,發現通過超聲動態聲像圖對犬DVT形成進行動態觀察,有助于觀察DVT的全過程,特別是對DVT早期的聲像圖特點的認識。張朝順等[10]將144只大鼠隨機分為S(假手術)組、N(正常對照)組、V1(不完全阻滯左股靜脈血流)組、V2(V1＋左下肢制動)組、V3(V1＋注入10%高滲鹽水1 m L)組、V4(V1＋注入凝血酶0.25 U)組,每組24只,通過比較各組血栓形成情況,分析病理學方面的差異,并通過病理檢查監測血栓不同時期的變化及血管再通情況,結果發現通過V3組的方法,可以建立符合臨床研究的DVT大鼠模型,這為DVT的病理轉歸及防治研究提供了新的可能。

3 血液高凝狀態的研究進展

血液由血漿和血細胞構成,血細胞中血小板在體內主要發揮止血功能,對膠原纖維有著較強的親和力。當內膜損傷后,血小板迅速黏附聚集于損傷部位,同時釋放凝血因子,使血液呈現高凝狀態,為血栓形成提供了可能。因此,可通過對多種DVT模型的血栓觀察,制定出具有針對性的血栓參考指標,并對其血栓彈性進行分析。

白云城等[11]采用狹窄法,將48只雌性大鼠制備成下腔靜脈血栓模型,研究發現造模后2 h有血栓開始形成,為典型的紅白、白色兩種血栓形態,其中紅色血栓以紅細胞為主,位于遠心端,白色血栓以血小板和纖維素為主,位于近心端,形成了對血栓形態的初步認知。吳鵬等[12]用結扎法,將30只大鼠下腔靜脈及其分支阻斷,并用微血管夾損傷靜脈壁以誘導DVT,于手術前第1日和手術后第1、4、7、10、14、21日采靜脈血檢測,研究發現纖維蛋白原、D-二聚體及凝血酶原時間可作為血栓形成的重要參考指標。YU F T H等[13]選用12只新西蘭大白兔隨機分為高聚集組和對照組,觀察左、右股靜脈腔內面積縮小后的急性反應及內皮損傷情況,每組其他5只僅在左股靜脈上接受血管狹窄和內皮損傷,對側右股靜脈作為聚集測量的配對對照,通過以上實驗發現,紅細胞聚集的顯著增加促進了大白兔股靜脈血栓形成,證實了局部血流動力學改變在DVT發病中的病理生理作用。劉曉娜等[14]采用單側靜脈狹窄法,將15只日本大耳白兔制備成下腔靜脈血栓模型,分別于血栓形成后第5、14日,在超聲剪切波彈性成像技術輔助下,檢測下腔靜脈血栓頭(近心端)、體、尾(遠心端)部的楊氏模量值,并于測量后處死大耳白兔,再將完整的下腔靜脈血栓取出,并制備成病理切片觀察,發現超聲剪切波成像技術下血栓彈性存在明顯異質性,這對于DVT下血栓彈性的研究提供了新的認知空間。

4 小結

1970年,就有學者將創傷研究的模型分為人體、人類學、活體動物和非物理模型4類[15],而活體動物模型在當今醫學界應用最廣,與此同時,由于理想的動物血栓模型并不存在,動物不會自發性的出現靜脈血栓癥[16],因此在DVT實驗中就選擇了與人類基因較為密切的活體動物如兔、大鼠、小鼠等,作為研究對象。雖然均存在大小、結構等的差異,但因其廉價、身體新陳代謝快,手術操作性強,能夠滿足學者模擬相關臨床環境的需求,被用于造模等。

近年來,高齡、肥胖、靜脈曲張、重度吸煙等人群明顯增多,成為靜脈血栓癥形成的高危因素,這些危險因素相互疊加、相互影響,以致在近期有大手術或嚴重創傷后、長期臥床、肢體制動等可能引起血流滯緩的情況下,導致血管內皮缺氧、血液高凝、氧化應激,從而促使DVT的發生[17]。因此,DVT的三大因素并不是獨立存在的,通常有著連鎖效應,具有針對性的損傷造模尤為重要。目前國內見諸報道的造模方式主要有結扎法[12]、狹窄法[11,14]、氯化鐵法[18]、血栓誘導劑干預法[9]等,都能建立可靠有效的DVT動物模型,同時測量血栓的重量、大小及組織學評估、影像技術的發展(如CT、核磁共振、高頻超聲)為動物模型的血栓測定提供了更加全面多樣的選擇途徑[19]。近年來也有學者提出新的血栓形成三要素:血管壁內皮細胞的活化、血小板黏附聚集和血漿中可溶性凝血因子的激活[20];通過無創操作檢測D-二聚體濃度與創傷患者的深靜脈血栓形成的相關性,具有一定的預測診斷價值[21];通過轉基因技術深入DVT模型的制備,研究其發病機制也是重要的研究途徑[22]。隨著動物實驗選材的多樣性,動物研究能夠從宏觀到微觀、從病因到病程、從治療到診斷,充分體現著制備DVT動物模型的重要性,也為臨床進行早期干預治療提供最佳時機、減少并發癥、改善患者預后提供了重要參考。