慢性腎衰竭病證結合動物模型的研究與思考?

李鵬飛，李思漢，陳揚榮，吳 競△

(1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院全國名老中醫(yī)藥專家陳揚榮傳承工作室，福州 350000；2.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣州 510006)

慢性腎衰竭是慢性腎臟病后期以腎功能進行性下降為主要特征的一種臨床綜合征[1]。因其并發(fā)癥多、預后差、醫(yī)療費用高等特點，已成為全世界迫切需要解決的健康問題之一[2]。自古以來，中醫(yī)無“慢性腎衰竭”之名，但中醫(yī)藥在慢性腎衰竭的診療中卻擁有獨特的優(yōu)勢和療效[3]。根據慢性腎衰竭的具體癥狀，屬于中醫(yī)學“關格”“水腫”“癃閉”等范疇[4]。近年來，關于本病的中醫(yī)基礎研究也逐漸深入。

中醫(yī)證候動物模型是連接中醫(yī)基礎與臨床的紐帶，是探求中醫(yī)藥對疾病作用機制的物質基礎[5]。病證結合模型同時兼具“病”與“證”的特點，其造模方法是當前最符合中醫(yī)辨證論治特色的一種模型構建方法，也是當前階段中醫(yī)藥動物實驗研究最廣泛應用的一種造模方式[6]。但目前慢性腎衰竭中醫(yī)藥研究模型仍以西醫(yī)疾病模型為主，病證結合模型鮮見，不能凸顯中醫(yī)辨證論治特色。因此構建一種準確、規(guī)范的慢性腎衰竭中醫(yī)證候動物模型，以病作為決定模型種類的依據，以證作為模型的特征，以病證結合的形式完成模型構建，將更好地促進慢性腎衰竭中醫(yī)科學研究的發(fā)展。

1 慢性腎衰竭病證結合動物模型的現(xiàn)狀分析

1.1 慢性腎衰竭病證結合動物模型造模方法

慢性腎衰竭病證結合模型屬于誘發(fā)性疾病動物模型,造模因素主要包括化學因素、物理因素，化學因素主要包含嘌呤霉素、阿霉素、腺嘌呤，物理因素主要包括大部腎切除、單側腎切除以及腎皮質電灼等方式[7]。慢性腎衰竭病證結合模型造模方法大致分為4種：一是先病后證。即通過手術、藥物等多種處理方式先構建西醫(yī)疾病或微觀病理改變的動物模型，而后通過單因素或多種因素干預形成特有的證候類型，這也是目前中醫(yī)藥動物實驗研究中最常用的造模方式[8]。如單側腎臟切除構建慢性腎衰模型1周后，通過阿霉素干預以制備慢性腎衰竭腎陽虛證模型[9]；二是先證后病。即在經過中醫(yī)病因干預后使動物先形成“證的模型”，再利用藥物、手術等方式構建相應的西醫(yī)疾病或病理模型[10]。如在電灼腎皮質建立血瘀證基礎上，切除單側腎臟構建慢性腎衰竭血瘀證模型[11]；三是病證同塑。即將“病”“證”模型的構建手段同時作用于模式動物，以制備證候動物模型。如通過靜脈注射阿霉素同時聯(lián)合腺嘌呤灌胃干預正常大鼠模型，建立慢性腎衰竭腎陽虛證模型[12]。因該方法具有獨特的時間概念，使模型更符合中醫(yī)致病理論及證候特點，能夠較真實地模擬中醫(yī)病因致病的特征及不同時期中醫(yī)證候的動態(tài)變化[13]；四是病中有證。“病”和“證”是中西醫(yī)對于人體健康狀態(tài)的不同表達方式，疾病的發(fā)展演化伴隨著證的動態(tài)變化，因此“有病即有證”。該方法僅對動物進行疾病模型的構建，而后通過四診收集、以方測證等方式辨別該模型的證候[14]。如王艷等[15]觀察四逆湯對單側輸尿管結扎法制備腎纖維化模型的體征、腎功能的影響，通過以方測證認為其符合慢性腎衰竭腎陽虛證表現(xiàn)。

1.2 慢性腎衰竭病證結合動物模型應用現(xiàn)狀

就慢性腎衰竭動物模型而言，阿霉素、腺嘌呤、單側或大部腎臟切除等“疾病”造模方式已逐漸成熟，但慢性腎衰竭證動物模型的實驗運用仍寥寥無幾。目前大部分慢性腎衰竭中醫(yī)藥實驗研究仍是以慢性腎衰竭疾病模型作為參照，以致喪失了中醫(yī)辨證論治、病證結合的特色，不能真正反映中藥或中醫(yī)治法與疾病證候之間的相關性。

經查閱文獻發(fā)現(xiàn)，僅有少數實驗[16-17]研究構建成功慢性腎衰竭腎陽虛證、血瘀證模型，且多數以“病中有證”方法建立，科研應用極少，復制率不高。此方法具有一定的科學性，也是當前階段相對較為科學的慢性腎衰竭病證結合動物模型的制備方法。但慢性腎衰竭病因復雜，當前階段動物辨證的標準及規(guī)范尚不統(tǒng)一，加之中醫(yī)的證具有相間錯雜性和動態(tài)可變性，單純的腎陽虛證或血瘀證極少見，若只是進行一次人為辨證或只用某一簡單方劑進行以方測證均有失偏頗。因此，對慢性腎衰竭常見證型的動物模型及致病因素方面的研究仍需積極探索。

1.3 慢性腎衰竭病證結合動物模型評價方法

慢性腎衰竭“病證結合”動物模型的評價體系尚待進一步完善，較為通用的評價方式以“疾病模型評價+證候模型評價”為主[18]。

慢性腎衰竭“疾病模型”評價內容主要包括對血肌酐、血尿素氮等指標的檢測及對腎臟組織的病理檢查。吳燕升[19]等發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腎大部分切除處理后大鼠體內血肌酐、尿素氮水平均明顯升高，病理檢查提示有局灶性間質纖維化、部分腎單位皺縮等表現(xiàn)。張健等[20]通過測定5/6腎切除大鼠血清肌酐、尿素氮情況，發(fā)現(xiàn)其與人類慢性腎衰竭患者臨床表現(xiàn)相符，認為5/6腎切除大鼠能較好地反映慢性腎衰患者各指標變化。

慢性腎衰竭“證候模型”評價則主要包括癥狀體征評價、以方測證、客觀指標(代謝組學)評價3個方面，以方測證、望聞問切四診癥狀體征評價是最為常用的2種方式。陳紅淑等[21]發(fā)現(xiàn)，腎氣丸能顯著改善腺嘌呤干預后慢性腎衰大鼠體質量、尿量、腎功能，因此認為腺嘌呤慢性腎衰竭大鼠能較好地切合中醫(yī)腎陽虛證。王梓等[22]通過對腺嘌呤處理后慢性腎衰竭大鼠的四診信息采集，判定該模型能較好地模擬慢性腎衰竭中醫(yī)腎陽虛證，其癥狀主要包括攝食量減少、畏寒肢冷、蜷縮拱背、消瘦、體毛枯疏、活動減少等。

代謝組學近年來在病證結合動物模型評價領域運用逐漸深入，其可以揭示系列關聯(lián)生物標記物的綜合差異，也可從整體上全面分析疾病對生物系統(tǒng)的影響[23]，具有整體性、動態(tài)性等特點。盧嫣等[24]采用代謝組學檢測方法發(fā)現(xiàn)L-2羥基谷氨酸、二腺苷五磷酸、二十六碳酰基甘氨酸3種特異性離子可作為慢性腎衰竭肝腎陰虛證患者血清代謝客觀評價標記物，且相關性較好。但代謝組學在慢性腎衰竭病證結合動物模型評價中尚未應用。腎臟具有排泄代謝廢物、維持內環(huán)境穩(wěn)定和內分泌等重要的生理功能[25]，慢性腎衰竭時伴隨的代謝改變更加突出。因此應用代謝組學進行慢性腎衰竭研究具有獨特的優(yōu)勢。基于慢性腎衰患者“同病異證”代謝組學與不同造模方法的慢性腎衰大鼠代謝組學研究及相關性分析也亟待解決。

2 慢性腎衰竭病證結合動物模型構建與評價思考

2.1 對慢性腎衰竭病證結合動物模型構建的思考

病是對疾病全過程的縱向總結，證是對疾病過程某一狀態(tài)的橫向判斷，病與證之間并不是相互獨立的存在，因此也不能將“病證結合”動物模型的“病與證”進行簡單的拆分，并簡單認為是“病+證”的動物模型。疾病的發(fā)生發(fā)展必定同時伴隨中醫(yī)證的產生和變化，將“病”“證”分開造模肯定不符合臨床實際。故構建慢性腎衰竭病證結合動物模型亦不能將“病”“證”獨立分開，而要將二者結合起來看，“病”與“證”只是從兩個角度對患者或動物模型同一健康狀態(tài)做出的不同判定而已。

另一方面，良好的穩(wěn)定性、可復制性是慢性腎衰竭病證結合動物模型需要具備的特點。但綜合當前模型構建方式，雖造模方法多種多樣，可模型的復制成功率及認可率均較低[26]。其原因綜合起來包括以下幾點。首先，人與動物在基因、生理病理、行為方式及生活環(huán)境等方面均存在極大的差異，因此需要明確，在實驗過程中不論何種因素誘導，均無法全面概括和復制出人類疾病的所有癥狀和體征，同一致病因素對于不同的動物個體也可能產生不同的證候表現(xiàn)。其次，造模所采用的致病因素不一定是直接引起證候發(fā)生的客觀因素，并且越多造模因素參與，病證結合模型的構建結果會越難把握，模型可重復性也就越低。單因素造模雖然條件單一、便于控制，但模型證候不能較好地反映疾病臨床特點也是其劣勢所在[27]。

實際上，自發(fā)性疾病動物模型被認為是與人類疾病發(fā)生發(fā)展最為相似的動物模型，不僅能夠反映疾病、證候的關聯(lián)，而且具有良好的穩(wěn)定性和可復制性[28]。應該加強對自發(fā)性慢性腎衰竭模型動物選擇、病理表現(xiàn)、辨證分型等多方面的研究，尋找與人類慢性腎衰、證候表現(xiàn)最為相似的造模動物，規(guī)范辨證客觀化標準，并利用基因改造、基因敲除、體細胞移植等技術實現(xiàn)不同證型的慢性腎衰竭動物模型的穩(wěn)定遺傳，為慢性腎衰竭中醫(yī)藥科學化研究提供更準確的實驗基礎。一方面可通過基因檢測等手段對不同證型患者腎組織進行基因測序，檢測腎臟突變基因，并在動物模型上進行人類基因改造，獲得與人類高度類似的慢性腎衰竭自發(fā)性動物模型；另一方面可考慮通過給NSG小鼠移植人的胚胎肝臟細胞來源的CD34細胞和同源胚胎胸腺組織塊,構建具有人正常免疫功能的小鼠模型。基于此類模型，給予基因改造以能夠表達患者來源的相關受體，建立部分自身免疫疾病所致人源化腎衰模型。人源化動物模型目前多運用于腫瘤、自身免疫疾病的研究，其動物模型構建技術尚處于不斷完善階段，相信高度人源化動物模型會是研究中醫(yī)證候本質的一個新手段。

2.2 對慢性腎衰竭病證結合動物模型評價方式的思考

慢性腎衰竭病證結合動物模型評價方式主要包括宏觀、微觀兩方面。以方測證、動物評價量表等方法側重于從動物癥狀、體征等宏觀層面進行模型評價，組學技術、各種理化指標則側重于從疾病不同證型生物學標志物方面進行評價分析。

“以方測證”強調有是證用是方，方藥有效即推測該模型具有該方所對應的證候。但是“以方測證”法不是“永真式”的，缺乏排他性設計，方證內涵的不確定性是其主要缺陷。如慢性腎衰竭脾腎氣虛及脾腎陽虛證的動物模型，雖然證候不同，但健脾益氣補腎之味對二者可能均有療效，導致該方法對動物模型證候的評價水準相對不足。因此，采用以方測證進行動物模型證候評價時必須考慮全面，用藥合理，切合疾病證候，具備相應的對照、排他設計(類方對照、拆方對照)。此外，不能僅僅通過疾病理化指標作為以方測證的方式，因為疾病理化指標并不一定具有中醫(yī)屬性，指標的轉變并不能代表中醫(yī)證候的轉變，所以以方測證必須結合相應的四診信息等作出綜合的證候判斷。

“動物模型評價量表”法將模式動物四診信息及體征表現(xiàn)半定量化、標準化，已能夠在一定程度上判定模式動物的證候類型，但動物與人類之間望聞問切信息具有一定差異性，大量動物四診信息尚未被挖掘，疾病與動物表征信息尚未有準確客觀的聯(lián)系標準。因此，動物體征宏觀量表評價方式及其四診信息收集不全面、大量信息篩選缺乏方法學依據、評價結果主觀化等缺陷仍需要進一步規(guī)避。對于慢性腎衰竭動物模型評價可以嘗試引入證素辨證體系，通過證候要素收集、評分，得出客觀準確的證候表達。但這一想法的實現(xiàn)仍需大家多加觀察及收集，篩選與各證候具有相關性的模型動物特征表現(xiàn)，同時通過計算機數學模型、信息評價等多學科方式建立更準確、可靠的慢性腎衰竭證候模型評價量表。

代謝組學技術是利用生物組織或體液的核磁共振波譜提供體內全部小分子代謝物信息的一種方式[29]，其具有整體性、動態(tài)性、可量化性，與中醫(yī)“整體觀”“證的動態(tài)可變性”有較高的吻合度。可以通過對比慢性腎衰竭不同證候類型患者之間尿液組學、血清蛋白組學、脂質組學、基因組學之間的差異，尋找不同證型慢性腎衰竭生物學標志，繪制可量化的慢性腎衰中醫(yī)證候圖譜，與不同造模動物、不同造模方式對比，得出更接近人類證候的病證結合動物模型。代謝組學技術的發(fā)展，必將打破中醫(yī)證候難以量化的局面，并將為慢性腎衰竭證候模型的建立及精準化提供一個更佳的方式。

但不論何種評價方式，總有其優(yōu)勢與不足。從“因-脈-證-治”方面建立宏觀、微觀多種相輔相成的評價模式，將是慢性腎衰竭動物模型評價體系的發(fā)展趨勢。

3 結語

總之，慢性腎衰竭病證結合模型的建立與評價仍需不斷完善。主要包括一是疾病與證候是2種不同醫(yī)學模式下對同一疾病的不同認識，二者并不獨立，要在動物模型上將二者結合尚需進一步努力；二是當前慢性腎衰竭病證模型并不能真實地反映疾病與證候的相關性及證候動態(tài)可變性，缺乏客觀化、可量化的動物模型評價方式；三是自發(fā)性疾病動物模型從動物內部模擬疾病發(fā)病過程，使得動物模型的疾病、病理與證候穩(wěn)定、均一、可重復性高，對自發(fā)性動物模型的探究，更利于建立理想的病證結合慢性腎衰竭動物模型；四是代謝組學技術能較好地體現(xiàn)慢性腎衰竭整體觀、證候動態(tài)可變性，而直觀可見、精準化的評價體系也將為慢性腎衰竭中醫(yī)證候精準模型構建及證的標準化研究提供新的視角。相信將來慢性腎衰竭病證結合模型建立與評價標準的客觀化、標準化，能更好地揭示慢性腎衰竭中醫(yī)“證”的本質，促進中醫(yī)慢性腎衰治療精準化發(fā)展，使中醫(yī)藥客觀嚴謹的科學研究得到進一步發(fā)展。