凍結(jié)肩動(dòng)物模型的建立及研究進(jìn)展

羅板鑫，朱文科，周 中,2,3*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬 中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210028；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028)

凍結(jié)肩是一種常見的肩關(guān)節(jié)疾病，其特征是肩關(guān)節(jié)主動(dòng)及被動(dòng)活動(dòng)度的逐漸喪失。凍結(jié)肩的發(fā)病率為3%～5%[1]，常見于 40～60 歲的中老年人群，多數(shù)患者為單側(cè)發(fā)病，雙側(cè)受累較少[2-3]，并且女性發(fā)病率較高[4-5]。臨床醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，包括糖尿病、外傷、偏癱、腦出血、甲狀腺功能亢進(jìn)、頸椎間盤突出癥、高膽固醇血癥、高脂蛋白血癥等在內(nèi)的許多系統(tǒng)性疾病均和凍結(jié)肩的發(fā)病有關(guān)[6-7]。凍結(jié)肩的原發(fā)病理部位[8]是盂肱關(guān)節(jié)囊組織，尤其以肩袖間隙為主，隨著病程進(jìn)展，局部的慢性炎癥反應(yīng)和纖維化增殖[9-12]是導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)疼痛、運(yùn)動(dòng)受限的主要原因。盡管對(duì)于凍結(jié)肩的臨床癥狀已經(jīng)研究的較為透徹且已經(jīng)存在相應(yīng)的治療方法，然而，導(dǎo)致肩周炎發(fā)生的病因和病理生理機(jī)制尚不明確，因此，臨床上并沒有公認(rèn)的最佳的治療方案。近年來，通過建立有效的動(dòng)物模型對(duì)凍結(jié)肩發(fā)病機(jī)理開展探索，取得了一系列重要的成果。隨著研究的不斷進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試了多種有效的造模方法并制定了相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)。本文在對(duì)主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分類的基礎(chǔ)上，著重就當(dāng)前凍結(jié)肩動(dòng)物模型的多種主流造模方法進(jìn)行歸納及綜述，從方法論的角度對(duì)凍結(jié)肩的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行多維度的描述，為臨床上發(fā)展真正有效的治療方案提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

隨著臨床技術(shù)及實(shí)驗(yàn)研究的不斷進(jìn)展，動(dòng)物模型在研究?jī)鼋Y(jié)肩的發(fā)病機(jī)制及治療新方案中愈發(fā)不可缺少。動(dòng)物模型可以動(dòng)態(tài)地觀察凍結(jié)肩的發(fā)病起始過程，通過對(duì)動(dòng)物標(biāo)本的分析，可以精確知悉發(fā)病部位，明確病理變化。目前已有嚙齒類、犬類以及多種大型動(dòng)物被用來制作凍結(jié)肩模型并開展針對(duì)性的研究。現(xiàn)就以下幾種主要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

1.1 嚙齒類動(dòng)物

小鼠是凍結(jié)肩動(dòng)物模型中比較常用動(dòng)物類目，小鼠飼養(yǎng)方便，易于獲取，費(fèi)用合理，造模周期短。但是由于體型較小，小鼠操作相對(duì)困難，目前用于人的凍結(jié)肩模型研究不多。現(xiàn)最常用的小鼠品系為C57BL/6，該品系于1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個(gè)特點(diǎn)就是品系穩(wěn)定和易于繁殖。

大鼠在實(shí)驗(yàn)研究中不僅具有小鼠的優(yōu)勢(shì)、還具有生存能力強(qiáng)、抗感染能力強(qiáng)、環(huán)境要求不高、易于獲得和大量復(fù)制、實(shí)驗(yàn)成功率高的特點(diǎn)。其岡上肌很發(fā)達(dá)，并穿過喙突、鎖骨、肩峰和連接這些骨性結(jié)構(gòu)的韌帶共同形成的拱形結(jié)構(gòu)，這和人類相似[13-14]，且大鼠肩關(guān)節(jié)外展活動(dòng)度大，可達(dá)到50°，它是目前較為廣泛應(yīng)用的凍結(jié)肩疾病研究模型動(dòng)物。但較兔子、犬類、其他大型動(dòng)物而言，大鼠的缺點(diǎn)與小鼠相似，其肌腱、關(guān)節(jié)囊、韌帶等軟組織細(xì)小，不適于觀察疾病的病理變化，也難以承擔(dān)修復(fù)損傷效果的觀察研究。現(xiàn)最常用的動(dòng)大鼠品系為SD(Sprague-Dawley)大鼠，其性情溫順，造模時(shí)對(duì)肩部外固定物的刺激反應(yīng)較小，易于固定制動(dòng)。

另一類常用的嚙齒類動(dòng)物是家兔，其性格溫順，體型較大，便于凍結(jié)肩發(fā)生的局部操作。家兔肩胛下肌與人類有類似的解剖學(xué)和生物力學(xué)特性，實(shí)驗(yàn)兔價(jià)格相對(duì)不高、生長(zhǎng)繁殖速度較快、便于飼養(yǎng)和管理，兔在籠養(yǎng)時(shí)，常用雙下肢站立而以雙上肢抱持他物，比其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上肢單獨(dú)活動(dòng)的機(jī)會(huì)更多，并且其上肢承擔(dān)體質(zhì)量行走的負(fù)荷較少，是廣泛適用的凍結(jié)肩模型動(dòng)物，不足為兔的肩峰是相對(duì)發(fā)育不全的結(jié)構(gòu)[15]，其下通過的是岡下肌腱、小圓肌腱而非岡上肌腱。常用的品系為新西蘭兔。

1.2 犬類

犬類不僅易于組織形態(tài)學(xué)觀察，并且對(duì)于關(guān)節(jié)內(nèi)容積、關(guān)節(jié)活動(dòng)度的實(shí)時(shí)測(cè)量也非常方便，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和準(zhǔn)確性比較好，犬的解剖結(jié)構(gòu)明顯與人類更相似，但犬類生長(zhǎng)發(fā)育周期較長(zhǎng)，造模成本較高、飼養(yǎng)難度系數(shù)較大，不利于進(jìn)行大樣本的研究。常用的品系為比格犬(Beagle),屬于獵犬中體型較小的一種，適用于長(zhǎng)期的慢性疾病實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 大型動(dòng)物

牛、羊、馬[16-19]等大型動(dòng)物可用于制作肩袖損傷及骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，現(xiàn)尚未有直接使用大型動(dòng)物制作凍結(jié)肩模型的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。但理論上，大型動(dòng)物極其適宜來觀察肌肉萎縮程度及韌帶、關(guān)節(jié)囊等的病理變化，對(duì)于治療后康復(fù)情況的觀察也比較直觀。

2 造模方法

從上世紀(jì)90年代開始，凍結(jié)肩的動(dòng)物模型逐步建立并發(fā)展。根據(jù)Zuckerman等[20]的分類方法，凍結(jié)肩可分為原發(fā)性凍結(jié)肩、繼發(fā)性凍結(jié)肩。原發(fā)性凍結(jié)肩也可以稱為特發(fā)性粘連性關(guān)節(jié)囊炎，發(fā)病與系統(tǒng)性疾病或外傷均無關(guān)。繼發(fā)性凍結(jié)肩分為系統(tǒng)性、外源性和內(nèi)源性。系統(tǒng)性凍肩關(guān)節(jié)患者更為常見，因?yàn)槿硐到y(tǒng)性疾病常常會(huì)有潛在的結(jié)締組織方面的異常，如糖尿病、帕金森氏綜合征。外源性凍結(jié)肩是指肩關(guān)節(jié)以外的疾病引發(fā)的凍結(jié)肩，如肱骨骨折、頸椎病。內(nèi)源性凍結(jié)肩是指由肩關(guān)節(jié)直接發(fā)生病理變化的，如肩袖損傷、肱二頭肌炎。繼發(fā)性凍結(jié)肩的具體誘因?qū)ζ漕A(yù)后有重要影響。比方說，與糖尿病相關(guān)的凍結(jié)肩，其病程更長(zhǎng)，治愈困難。原發(fā)性性凍結(jié)肩與繼發(fā)性凍結(jié)肩，其病理過程都以炎癥、纖維化為主，肩部的臨床癥狀基本一致。由于繼發(fā)性凍結(jié)肩造模的方便性，故現(xiàn)在都是從繼發(fā)性凍結(jié)肩作為理論出發(fā)點(diǎn)，來制作凍結(jié)肩動(dòng)物模型。本文根據(jù)現(xiàn)有的國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，將凍結(jié)肩動(dòng)物模型的制作方法歸納為模擬理化條件法、外固定制動(dòng)法、外科手術(shù)法三大類。

2.1 模擬理化條件法

人為的制造利于凍結(jié)肩發(fā)病的內(nèi)、外在環(huán)境，然后將動(dòng)物放置于這種環(huán)境中，以此刺激動(dòng)物的肩部從而誘發(fā)凍結(jié)肩。

2.1.1 模擬風(fēng)寒濕刺激模型

王緒輝等[21]從中醫(yī)理論角度出發(fā)，結(jié)合實(shí)際臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為風(fēng)寒濕邪對(duì)凍結(jié)肩的產(chǎn)生具有重要作用。以風(fēng)寒濕為出發(fā)點(diǎn)，采用兔子作用動(dòng)物模型造模。在家兔一側(cè)肩部，脫毛后以室溫7℃、相對(duì)濕度97%、風(fēng)力6級(jí)進(jìn)行間斷性刺激造模。經(jīng)造模48 h后發(fā)現(xiàn)肩部略有腫脹但活動(dòng)受限不明顯，造模14 d后出現(xiàn)明顯的活動(dòng)受限癥狀。病理結(jié)果顯示了這一過程中肩部局部微血管呈收縮、擴(kuò)張、收縮、再擴(kuò)張的變化過程。局部組織厚度增加，周圍組織炎性浸潤(rùn)，同時(shí)可見皮下、肌腱、關(guān)節(jié)周圍組織粘連。實(shí)驗(yàn)闡述了寒冷、潮濕造成的刺激是局部微循環(huán)障礙、炎性反應(yīng)是肩部疼痛及活動(dòng)受限的主要因素。

肩周炎屬中醫(yī)痹癥范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》言“風(fēng)、寒、濕三氣雜至合而為痹，其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹”。該模型揭示了風(fēng)寒濕對(duì)肩周炎的病因?qū)W意義，其優(yōu)點(diǎn)是造模方法簡(jiǎn)單，條件單一便于控制，但同時(shí)所復(fù)制出來的證并不能完全反映臨床疾病的所有特點(diǎn)，因此模型較為片面，比較模糊；操作上具體如何維持風(fēng)寒濕刺激，以及對(duì)肩部有何具體的處理需進(jìn)一步研究，本模型適宜于兔子等較大體型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

2.1.2 模擬勞損及寒濕刺激模型

熊昌源等[22-23]詳細(xì)說明了模擬寒濕的方法，并加用持續(xù)機(jī)械性勞損進(jìn)行造模。這種造模方法分為兩個(gè)階段，先將兔子一側(cè)前肢連接于水平搖床上，以一定的頻率與振幅搖動(dòng)肩關(guān)節(jié)，以此持續(xù)數(shù)天。之后，將冰塊外敷于其肩部持續(xù)刺激數(shù)天。這種將內(nèi)因和外因相結(jié)合的造模方式，與臨床凍結(jié)肩病因?qū)W更為接近。也有人使用大鼠[24]作為造模動(dòng)物。研究從微循環(huán)、病理組織學(xué)及相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定等多方面驗(yàn)證了此模型的科學(xué)性和可行性。模型動(dòng)物肩微循環(huán)血流速度緩慢，軟組織腫脹明顯，肌纖維退變，結(jié)締組織增生，滑膜粘連，肱二頭肌腱中羥脯氨酸、DNA 和蛋白質(zhì)明顯增高，超氧化物歧化酶下降明顯，脂質(zhì)過氧化物升高顯著。此方法優(yōu)點(diǎn)是為復(fù)合因素造模，比單一因素造模更接近中醫(yī)臨床表現(xiàn)，有利于探討中醫(yī)藥的療效和機(jī)理，這種造模方法操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、比較容易推廣，適應(yīng)大鼠、兔等多種模式動(dòng)物，也是我國(guó)應(yīng)用最為廣泛的，尤其在中醫(yī)研究中[25]。缺點(diǎn)是這種模型在束縛動(dòng)物時(shí)，動(dòng)物依從性較差，有一定概率造成動(dòng)物受傷、死亡、造模失敗，模型穩(wěn)定性需進(jìn)一步研究；造模完成后，缺乏客觀的測(cè)量指標(biāo)，只能憑借經(jīng)驗(yàn)來斷定造模是否成功。基于這一方法，目前不少研究者正在努力嘗試?yán)弥饔^判斷和客觀指標(biāo)相結(jié)合的方法，來判定造模效果。例如，王晨瑤等[26]通過大致觀察步態(tài)、肩部活動(dòng)情況、測(cè)量血清PGE-2含量，評(píng)判造模效果。康佳珺等[27]則采用步態(tài)Coderre分級(jí)、測(cè)量肩關(guān)節(jié)周長(zhǎng)進(jìn)一步量化了造模效果，并測(cè)量造模前后血清中IL-1量、TNF-量、COX-2等炎性指標(biāo)的變化。

2.1.3 內(nèi)分泌紊亂模型

糖尿病是凍結(jié)肩的重要發(fā)病因素之一。相關(guān)研究稱T2DM大鼠模型其盂肱關(guān)節(jié)活動(dòng)度低于正常水平[28]，T2DM可導(dǎo)致大鼠肩關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及周圍肌肉等軟組織出現(xiàn)炎性改變及纖維化[29]，與肩周炎肩周軟組織自然退變病理特點(diǎn)一致。T2DM大鼠肩部滑膜組織內(nèi)VEGF表達(dá)增多，微循壞障礙[30]，可能是糖尿病誘導(dǎo)凍結(jié)肩發(fā)病的機(jī)制之一。糖尿病動(dòng)物模型可以在研究糖尿病易發(fā)凍結(jié)肩的因素方面發(fā)揮重要作用。腎上腺功能異常、甲狀腺功能異常等其他內(nèi)分泌疾病也與凍結(jié)肩發(fā)病相關(guān)，但目前缺乏該方面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 外固定制動(dòng)法

運(yùn)用石膏、繃帶等體外固定方法將動(dòng)物的一側(cè)上肢固定，限制肢體的自主活動(dòng)，達(dá)到使肩關(guān)節(jié)逐漸粘連、關(guān)節(jié)活動(dòng)度逐漸喪失的目的。

Schollmeier等[31]報(bào)道了采用犬類制造外固定制動(dòng)凍結(jié)肩模型的一種有效方法。將犬的一側(cè)前肢用人字形石膏同肩部以30°向后屈曲位固定。這種造模方法，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)囊的組織形態(tài)變化出現(xiàn)在盂肱關(guān)節(jié)的功能變化之前。在造模4周后，關(guān)節(jié)活動(dòng)度變化不明顯。但是，此時(shí)組織學(xué)上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞及滑膜下毛細(xì)血管增加，滑膜表面有局灶性起伏和絨毛結(jié)構(gòu)。這表明，毛細(xì)血管在整個(gè)滑膜結(jié)締組織中明顯增生，且有部分呈充血狀態(tài)。另外，在滑膜下組織的某些區(qū)域，脂肪成分被致密的纖維膠原組織所取代。造模8周后，發(fā)現(xiàn)肩部的前后屈伸活動(dòng)度均明顯降低，組織學(xué)表現(xiàn)粘連灶開始出現(xiàn)在鄰近的滑膜表面，包括肩峰下滑囊、關(guān)節(jié)囊與關(guān)節(jié)軟骨之間。第12周后的關(guān)節(jié)活動(dòng)度變化較第8 周并沒有明顯改變。造模4周后關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓力變化不明顯，但是在第8周有顯著變化并逐步上升。同時(shí)在第12 周時(shí)關(guān)節(jié)囊容積急劇減少，實(shí)驗(yàn)上僅僅注射6～8 mL液體，關(guān)節(jié)囊就會(huì)破裂，而正常情況下可以注射13～15 mL。造模12周時(shí)，發(fā)現(xiàn)了凍結(jié)肩最顯著性的特征——關(guān)節(jié)囊攣縮，這時(shí)的關(guān)節(jié)活動(dòng)度、關(guān)節(jié)腔內(nèi)壓力變化明顯，且組織學(xué)改變與凍結(jié)肩較為相似，故認(rèn)為造模12周為最佳時(shí)段。在隨后進(jìn)一步的研究中，Schollmeier等[32]對(duì)該模型是否可逆轉(zhuǎn)進(jìn)行了研究。在功能重塑期4周時(shí)，犬的肩部肌肉基本恢復(fù)了正常的輪廓。除了內(nèi)旋外，關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度無明顯改善。運(yùn)動(dòng)時(shí)關(guān)節(jié)內(nèi)壓力顯著減低，但關(guān)節(jié)內(nèi)容積無明顯改善。重塑8周時(shí)，功能、結(jié)構(gòu)變化均開始逆轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度恢復(fù)到了正常值的80%。重塑12周后肩部功能、組織學(xué)基本恢復(fù)到造模前的情況。此外，該方法還發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)囊攣縮似乎與關(guān)節(jié)囊中的膠原蛋白成分無關(guān)，功能和運(yùn)動(dòng)減少的部分原因是關(guān)節(jié)囊結(jié)構(gòu)的改變。

由于大鼠肩部解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，而且大鼠模型易于獲得和大量復(fù)制，所以Kim等人[33]選擇大鼠作為凍結(jié)肩的造模動(dòng)物。保持大鼠一側(cè)肩部完全內(nèi)收、內(nèi)旋位，同側(cè)肘關(guān)節(jié)屈曲、旋前，通過在整個(gè)前肢及胸部涂上成型石膏，將一側(cè)前肢以上述體位制動(dòng)固定于胸部。大鼠另一側(cè)肢體作為對(duì)照組。Kim等人觀察了造模后3 d、1周、2周、3周、4周、5周、6周外展角及組織學(xué)情況。在造模1周后，外展角開始顯著減少。在2～3周時(shí)，達(dá)到最低點(diǎn)，這時(shí)健側(cè)及空白組大鼠的外展角為150～160°左右，而實(shí)驗(yàn)組只有100°左右。造模4周、5周、6周后，外展角較第2周、第3周變化不大。組織學(xué)發(fā)現(xiàn)腋窩的滑膜及滑膜下結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。此外，滑膜皺襞的減少、滑膜下脂肪組織減少、滑膜下組織毛細(xì)血管增生、關(guān)節(jié)囊增厚等現(xiàn)象在石膏外固定3 d后就已經(jīng)出現(xiàn)。1周后，滑膜下脂肪組織幾乎消失，關(guān)節(jié)囊明顯增厚。2周后，肱骨側(cè)的滑膜及滑膜下組織緊貼于骨皮質(zhì)，這時(shí)可以開始觀察到滑膜組織中有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。但是，3周后，滑膜及滑膜下組織的炎細(xì)胞減少，主要以纖維化表現(xiàn)為主。此后，外固定4周、5周、6周時(shí)的組合學(xué)表現(xiàn)與第3周相似。相應(yīng)的，Masson三色染色發(fā)現(xiàn)外固定3 d后開始有纖維化的表現(xiàn)，在第3周時(shí)最大化。因?yàn)殛P(guān)節(jié)活動(dòng)度在第2～3周達(dá)到最低，組織學(xué)表現(xiàn)也在第3周時(shí)趨于穩(wěn)定，所以Kim等人認(rèn)為，使用石膏外固定3周可以取得最佳的造模效果。需要指出的是，炎性反應(yīng)最終導(dǎo)致纖維化的病理生理過程與凍結(jié)肩極其相似，Kim等人首次在動(dòng)物模型中闡述了這種機(jī)制。根據(jù)時(shí)間段劃分，造模3 d到2周的時(shí)候主要以炎癥反應(yīng)為主，與人類凍結(jié)肩的疼痛期病理生理相似。造模3周以后主要以纖維化為主，與凍結(jié)肩的凍結(jié)期病理生理相似。這個(gè)過程也側(cè)面反應(yīng)了原發(fā)性凍結(jié)肩和繼發(fā)性凍結(jié)肩的臨床差別性。與Schollmeier等人的研究工作相比，Kim等人的造模方法更加完善，他們充分考慮到了石膏的相關(guān)并發(fā)癥，并進(jìn)行了相應(yīng)地處理。

Liu等[34]將大鼠的一側(cè)肩關(guān)節(jié)分別固定1、2、3、4周。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)準(zhǔn)備肩部進(jìn)行一系列的盂肱關(guān)節(jié)組織學(xué)觀察、免疫組化觀察，探討固定對(duì)肩胛下囊和關(guān)節(jié)囊內(nèi)容物的影響，包括I型和III型膠原在固定化大鼠肩內(nèi)的分布，結(jié)果表明，大鼠肩關(guān)節(jié)固定術(shù)引起關(guān)節(jié)囊滑膜增生、肩胛下囊粘連、關(guān)節(jié)囊內(nèi)I型和III型膠原內(nèi)容物增加。

長(zhǎng)期的制動(dòng)是繼發(fā)性凍結(jié)肩發(fā)病的重要因素。因此，大多數(shù)學(xué)者都采用各種各樣的制動(dòng)手段進(jìn)行誘導(dǎo)，使動(dòng)物的肩關(guān)節(jié)粘連、關(guān)節(jié)囊攣縮，從而完成凍結(jié)肩動(dòng)物模型的建立。外固定制動(dòng)法直接在關(guān)節(jié)外操作，無手術(shù)創(chuàng)傷影響，有效的避免了手術(shù)帶來的相關(guān)并發(fā)癥及缺點(diǎn)。該方法操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，材料易于獲取，適合于外界因素導(dǎo)致的凍結(jié)肩的研究；缺點(diǎn)是固定過程中動(dòng)物感覺不適、撕咬，破壞固定材料，以及固定不牢等，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，造成實(shí)驗(yàn)失敗。而且固定的技術(shù)、材料和模型動(dòng)物的個(gè)體差異會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用犬類等較大的動(dòng)物作為造模對(duì)象，不僅易于組織形態(tài)學(xué)觀察，并且對(duì)于關(guān)節(jié)內(nèi)容積、關(guān)節(jié)活動(dòng)度的實(shí)時(shí)測(cè)量也非常便利，Schollmeier等人的實(shí)驗(yàn)首次對(duì)模型造模時(shí)間、造模后所維持的時(shí)間進(jìn)行了詳細(xì)研究，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的定量研究和時(shí)機(jī)把握具有重要的指導(dǎo)意義。使用小型動(dòng)物進(jìn)行外固定制動(dòng)雖然觀察、測(cè)量及操作稍有不便，但易于獲得和大量復(fù)制，造模時(shí)間更短，因此是一種值得推廣的造模方式。

2.3 外科手術(shù)法

通過手術(shù)的方式，制作凍結(jié)肩模型，根據(jù)原理可以歸納為大致三種方法。第一種，以手術(shù)的方式加快肩部慢性勞損。第二種，破壞肩關(guān)節(jié)周圍肌肉，使肩部主動(dòng)活動(dòng)受限。第三種，在肩部及同側(cè)上肢做內(nèi)固定，限制肩部活動(dòng)。這種方法通過破壞、刺激相關(guān)組織、造成關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境因素的變化，模擬相關(guān)生理?xiàng)l件誘導(dǎo)產(chǎn)生動(dòng)物模型。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于手術(shù)造模方法穩(wěn)定性好，易成功，可短期內(nèi)完成造模，因此目前應(yīng)用也日益廣泛；然而，這一方法的缺點(diǎn)是手術(shù)造成的創(chuàng)傷及易出現(xiàn)感染可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，對(duì)操作人員、設(shè)備及技術(shù)要求較高，不易大批量造模，不適應(yīng)觀察炎癥介質(zhì)等表達(dá)。

2.3.1 手術(shù)模擬肩部勞損模型

褚立希等[35]認(rèn)為慢性勞損是肩關(guān)節(jié)周圍炎的重要致病因素，他們通過外科手術(shù)模擬了肩部慢性勞損的生理?xiàng)l件。收縮牽拉兔子一側(cè)肩部的岡上肌、三角肌，對(duì)岡上肌、三角肌下滑囊對(duì)應(yīng)的深淺面，并對(duì)關(guān)節(jié)囊外壁做輕微、持續(xù)性的鈍性摩擦。造模完成后，在不同時(shí)間段，對(duì)三角肌、岡上肌、斜方肌、滑囊及關(guān)節(jié)囊組織進(jìn)行HE染色觀察。發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織變性壞死以及漿液性纖維素滲出等現(xiàn)象。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在造模7 d達(dá)到高峰，12～14 d開始逐漸減少。組織變性壞死在3 d達(dá)到高峰，之后逐漸減少。造模3 d，開始出現(xiàn)有少量纖維母細(xì)胞出現(xiàn)，隨后纖維化程度不斷增加，在8周后出現(xiàn)肌腱鈣化。該實(shí)驗(yàn)造模后經(jīng)過8周的病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)控制炎癥對(duì)改善功能、緩解肩部疼痛有重要意義。對(duì)兔子肩部肌肉進(jìn)行牽拉、摩擦，這與人體肩關(guān)節(jié)日常活動(dòng)勞損相似，符合生理解剖學(xué)及生物力學(xué)。

褚立希等[35]的慢性勞損模型，對(duì)肌肉、軟組織的刺激是以肉眼觀察輕度組織反應(yīng)為度，不同手術(shù)者評(píng)價(jià)的指標(biāo)不一，不同造模動(dòng)物的反應(yīng)耐受也不一，對(duì)于不同模型，缺乏刺激時(shí)間、刺激范圍等因素的定量性刻畫，因而缺乏相對(duì)客觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.3.2 肩袖損傷模型

肩袖損傷造成肩關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，并且創(chuàng)傷加劇炎癥刺激，這種長(zhǎng)期活動(dòng)受限及炎性刺激，是凍結(jié)肩的臨床發(fā)病因素之一。所以肩袖損傷的動(dòng)物模型也可以來誘導(dǎo)凍結(jié)肩動(dòng)物模型的產(chǎn)生。肩袖組織分為岡上肌、岡下肌、肩胛下肌、小圓肌四部分，可以通過破壞其中一部分或多個(gè)部分來達(dá)到建立模型的目的。大鼠肩峰處有一拱形結(jié)構(gòu)，岡上肌在其下方穿行，與人類岡上肌結(jié)構(gòu)類似。兔子的肩峰為相對(duì)發(fā)育不全的結(jié)構(gòu)，但其肩胛下肌與人類的解剖結(jié)構(gòu)類似。大型動(dòng)物，如豬、羊等，其岡下肌在肩關(guān)節(jié)活動(dòng)中為優(yōu)勢(shì)肌群。根據(jù)上述內(nèi)容，在肩袖損傷模型中，大鼠常常是破壞其岡上肌，兔子破壞其肩胛下肌，豬、羊等大型動(dòng)物破壞其岡下肌。這種方式直接破壞了部分肩袖肌纖維組織，人為的破壞了肩關(guān)節(jié)外展、外旋等主動(dòng)活動(dòng)功能，其短期造模為單純的肩袖損傷模型，長(zhǎng)期造模(12周以上)為誘導(dǎo)的繼發(fā)性凍結(jié)肩模型。有王盼盼[36]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種大鼠模型肩關(guān)節(jié)滑膜組織中 TGF-β1、MMP-14、vegf 等相關(guān)基因表達(dá)是增多的。

2.3.3 塑料板內(nèi)固定模型

隨著對(duì)造模探索的深入，有研究者認(rèn)為Schollmeier等人提出的造模方法的主要缺陷在于每個(gè)動(dòng)物的肢體位置不同從而導(dǎo)致固定方法、固定位置不一，并且石膏外固定后隨著時(shí)間的推移，原本固定的位置也或多或少的會(huì)發(fā)生改變。最近，Kanno等人[37]發(fā)明了一種新的內(nèi)固定方式進(jìn)行造模。他們?cè)诖笫箅殴翘幒图珉喂翘幏謩e做2個(gè)切口。在肩胛骨切口處，將一塊特制的塑料板的上端放置在肩胛骨下端腹側(cè)，另一塊塑料板的上端放在肩胛骨下端背側(cè)。用1根雙股柔性導(dǎo)線，背側(cè)連接鋼板的上端。在肩胛岡上使用針頭進(jìn)行鉆孔，從孔內(nèi)穿過背側(cè)的導(dǎo)線，用該雙股線穿過肩胛骨上端，連接腹側(cè)鋼板的上端，然后將其扭轉(zhuǎn)并牢固固定。在肱骨切口處，2塊鋼板的下端使用螺釘進(jìn)行剛性固定。在大鼠肩部，由于結(jié)構(gòu)的特殊性，外展60°相當(dāng)于人類的0°。以此位置，肩關(guān)節(jié)被固定在外展60°的位置。內(nèi)固定8周后造模完成。

為了定量每一種組織對(duì)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)的限制，在取下內(nèi)固定后、移除除了肩袖組織以外的肌肉、移除除了關(guān)節(jié)囊外的肩袖組織、切除前下方關(guān)節(jié)囊、切除前上方關(guān)節(jié)囊、切除后下方關(guān)節(jié)囊后，分別測(cè)量了大鼠肩部的外展角和總旋轉(zhuǎn)角進(jìn)行了測(cè)量。取下內(nèi)固定后，實(shí)驗(yàn)組外展角大約為66°左右，假手術(shù)組的外展角大約在79°。實(shí)驗(yàn)組旋轉(zhuǎn)角大約是17°，假手術(shù)組大約在43°。這個(gè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，切除前上方關(guān)節(jié)囊和前下方關(guān)節(jié)囊后，關(guān)節(jié)活動(dòng)度均有明顯提升。所以，關(guān)節(jié)攣縮的主要表現(xiàn)在前上方關(guān)節(jié)囊和前下方關(guān)節(jié)囊。

組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，造模后引起的最明顯的變化在于腋窩袋被厚的滑膜下組織所遮擋。假手術(shù)組滑膜表面有滑膜皺褶，而實(shí)驗(yàn)組滑膜皺褶消失。結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組滑膜內(nèi)膜長(zhǎng)度明顯縮短。此外，6只造模動(dòng)物中有4只的滑膜下組織附著在軟骨上。在實(shí)驗(yàn)組中，觀察到1只大鼠的肩關(guān)節(jié)窩前下段可見明顯的滑膜粘連。2只大鼠的肩部關(guān)節(jié)窩的下方1/4有粘連。其他標(biāo)本，只發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)窩中心有粘粘。實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組均未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜襯里細(xì)胞增生等滑膜炎改變。除滑膜外，兩組間肌腱、肌腱插入及肩峰下區(qū)無明顯變化。免疫組化結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組滑膜組織的Ⅲ型膠原染色陽性，尤其是深部滑膜內(nèi)膜下區(qū)的染色強(qiáng)于滑膜內(nèi)膜，而假手術(shù)組的滑膜組織染色沒這么明顯。

這是一種以內(nèi)固定方式而誘導(dǎo)繼發(fā)性肩關(guān)節(jié)攣縮的動(dòng)物模型。它與人類凍結(jié)肩Frozen期的病理生理更為接近，即炎性反應(yīng)不明顯，滑膜皺襞消失。人類患有凍結(jié)肩時(shí)，常常以外旋受限為第一癥狀，繼而是外展等其他方向的活動(dòng)。但該大鼠模型中，以外展更為明顯，這可能與造模的方式及大鼠的生理結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.3.4 線結(jié)內(nèi)固定模型

Ochiai等[38]同樣采用內(nèi)固定的方案進(jìn)行造模，但是他們的手術(shù)方式化繁為簡(jiǎn)，沒有使用螺釘、塑料板等剛性固定物，單純的使用一根不可吸收線將肩胛骨與肱骨干下端固定制動(dòng)。制動(dòng)8周后，Ochiai等人將內(nèi)固定及肩部周圍肌肉摘除后，測(cè)量了關(guān)節(jié)活動(dòng)度，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組平均外展角為139°、總旋轉(zhuǎn)角為97.3°，實(shí)驗(yàn)組的平均外展角為36.3°、總旋轉(zhuǎn)角為73.3°。同時(shí)，Ochiai等人還發(fā)現(xiàn)降鈣素相關(guān)基因肽在肩部游離神經(jīng)末梢陽性表達(dá)可能與肩部疼痛有關(guān)。

Villa等[39]對(duì)該模型取下內(nèi)固定直至8周后的功能恢復(fù)情況進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。在造模完成后，取下內(nèi)固定時(shí)大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)度僅為原來的37%左右。到5周后后，關(guān)節(jié)活動(dòng)度逐漸恢復(fù)至原有的81%左右。第5～8周，關(guān)節(jié)活動(dòng)度的改善并不明顯。8周觀察結(jié)束后，關(guān)節(jié)活動(dòng)度恢復(fù)到原先的82%左右。而大鼠的關(guān)節(jié)僵硬程度在取下內(nèi)固定3周后，改善就不是很明顯。Villa等人的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了他自己的猜想，這種固定所誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)活動(dòng)度降低、關(guān)節(jié)僵硬至少可持續(xù)8周。

凍結(jié)肩常常與糖尿病、甲狀腺功能異常、帕金森氏綜合征等疾病共存，內(nèi)分泌、遺傳因素與凍結(jié)肩的發(fā)病密切相關(guān)。現(xiàn)在的研究從凍結(jié)肩的病理和潛在靶基因?yàn)橹委熖峁┝诵碌姆较颉Ｔ诜肿由飳W(xué)水平上了解病因，對(duì)凍結(jié)肩的預(yù)防及治療至關(guān)重要。小鼠的基因標(biāo)記及轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對(duì)成熟，且各種動(dòng)物中，小鼠與人類的基因最為接近，因此Satoshi等人認(rèn)為，最佳的造模動(dòng)物為小鼠。Oki等[40]最近采用了與前者相同的術(shù)式，利用小鼠造模，獲得了一系列有意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 總結(jié)

模擬理化條件法造模操作簡(jiǎn)單，成模率高，易操作，貼近臨床致病因子，這種將內(nèi)外因相結(jié)合的造模方式，與臨床凍結(jié)肩病因?qū)W更為接近，但造模因素相對(duì)有限，動(dòng)物束縛效果影響造模成效；外固定制動(dòng)法操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，不受手術(shù)創(chuàng)傷影響，缺點(diǎn)是固定過程中動(dòng)物感覺不適、破壞固定材料，固定不牢以及固定的技術(shù)、材料等影響造模效果；手術(shù)方法穩(wěn)定性好，可短期內(nèi)完成造模，易成功，但手術(shù)造成創(chuàng)傷大，易出現(xiàn)術(shù)后感染或其他并發(fā)癥狀，造模技術(shù)和設(shè)備要求較高，不適應(yīng)觀察炎癥介質(zhì)表達(dá)。基于這些方法，近年來大鼠、小鼠、犬類、兔子等動(dòng)物被用來制作凍結(jié)肩模型，并開展針對(duì)性的研究。我國(guó)學(xué)者在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)鼋Y(jié)肩有著獨(dú)到的見解，模擬勞損加寒濕刺激模型與中醫(yī)凍結(jié)肩病因病機(jī)相似，所以許多國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用模擬勞損加寒濕刺激模型。另一方面，一些學(xué)者常使用針灸、針刀、穴位等傳統(tǒng)療法，兔子的肩部利于實(shí)施這些操作，他們常使用兔子為動(dòng)物模型。國(guó)際上，大多數(shù)學(xué)者采用固定制動(dòng)的方式進(jìn)行造模，研究發(fā)現(xiàn)大鼠的肩部大體解剖與人類相似，而且大鼠無論是采用外固定還是手術(shù)內(nèi)固定都較為方便，所以他們大多采用大鼠作為造模動(dòng)物，他們對(duì)動(dòng)物模型的可逆性、組織學(xué)、測(cè)量關(guān)節(jié)活動(dòng)度的方式等有著更定量化和更深層次的研究。由于原發(fā)性凍結(jié)肩動(dòng)物模型的建立現(xiàn)在還存在著技術(shù)難題，因此固定制動(dòng)所誘導(dǎo)的繼發(fā)性凍結(jié)肩動(dòng)物模型在研究上應(yīng)用日益普遍。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，良好的疾病模型是研究的基礎(chǔ)，更是實(shí)驗(yàn)結(jié)論可靠性的保證，在實(shí)際科學(xué)研究中，應(yīng)根據(jù)各種凍結(jié)肩動(dòng)物模型的特點(diǎn)、造模機(jī)制及研究目的來綜合考慮，以選擇和建立理想的凍結(jié)肩動(dòng)物模型。