RNA結合蛋白HuR的研究進展及其在肝細胞癌發生發展中的作用*

蘇 瑩，金 春，孫蘇敏，李章昊，夏思偉，張自力，2，3，張 峰，2，3，邵江娟，2，3△，鄭仕中，2，3△

［南京中醫藥大學 1江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2江蘇省中藥功效物質重點實驗室，3中藥品質與效能國家重點實驗室（培育），江蘇南京210023］

轉錄后事件，特別是mRNA 翻轉和翻譯的改變，是哺乳動物細胞在應激反應中控制基因表達的主要機制。mRNA 穩定性和翻譯的變化主要是通過特定mRNA 序列（順式元件）與兩種主要的反式作用因子——RNA 結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）和微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用而啟動的過程來控制的［1］。RBP 參與RNA 代謝的各個環節，包括RNA 剪接、多聚腺苷酸序列編輯、RNA 轉移、維持RNA 的穩定和降解、細胞內定位和翻譯調控等。胚胎致死性視覺異常（embryonic lethal abnormal vi?sion，ELAV/Hu）家族蛋白是唯一通過識別3′端非翻譯區（3′-untranslated region，3′UTR）中的富含AU 元件（AU-rich element，ARE）來穩定mRNA的RBP。多數Hu 蛋白家族成員（Hu-B、C 和D）只在中樞神經系統表達，HuR（ELAVL1）是唯一在人類中廣泛表達的成員［2］。本文總結HuR 的功能，并介紹其在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）方面的研究進展，以期為未來HCC的治療研究提供新的可能靶點。

1 HuR的主要功能

HuR 是目前研究較為廣泛的轉錄后基因表達調控因子之一，在炎癥、腫瘤、細胞凋亡、細胞增殖和血管生成中發揮重要作用。HuR 蛋白由3 個RNA 識別基序（RNA recognition motif，RRM）和1 個柔性鉸鏈區組成，RRM 主要識別靶mRNA 3′UTR 中的ARE，以穩定這些mRNA 并促進它們的翻譯。HuR 是一種核質穿梭蛋白，主要定位于細胞核；在各種刺激（如病毒感染、細胞因子、熱休克和紫外線照射）下，HuR移位到細胞質，這是其穩定mRNA 功能所必需的［3］。HuR實現這些效應潛在機制是HuR通過與其他限制性RBP（如tristetraprolin，TTP）和miRNA 競爭來防止靶mRNA 降解。目前，許多因子已被證明是HuR的下游靶點，尤其是細胞因子、腫瘤因子和炎癥因子。因此，HuR 表達增加或核漿分布異常總是伴隨著炎癥的加重和腫瘤的不良轉化。

1.1 穩定靶RNA 大量的mRNA，如環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、白細胞介素8（interleu?kin-8，IL-8）、趨化因子CCL2、趨化因子CCL8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和細胞周期蛋白（cyclin）的mRNA 被鑒定為HuR 靶點。通過這種方式，HuR 參與了生物過程的許多方面，如炎癥和腫瘤進展。

TNF-α/鈣網蛋白（calreticulin，CRT；內質網常駐蛋白，負責維持Ca2+穩態和糖蛋白折疊）雙信號通路可誘導類風濕關節炎大鼠核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization do?main-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體激活，并與HuR 核質穿梭有關。TNF-α（信號1）通過誘導HuR 由胞核移位到胞漿，穩定NLRP3 mRNA，從而促進NLRP3蛋白表達；在CRT（信號2）作用下，NLRP3寡聚體形成，引起caspase-1 裂解，進而觸發IL-1β 的裂解分泌［4］。SNAIL 是一種轉錄因子，它能抑制Ecadherin，并激活N-cadherin，在胚胎發育和細胞遷移期間調節上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［5］。HuR 能夠與SNAIL mRNA 結合并使其穩定，增加了EMT，從而促進了腫瘤細胞的遷移［6］；SNAIL mRNA 上ARE1 的缺失降低了SNAIL mRNA 的穩定性，表明HuR 通過ARE1 與SNAIL 的3′UTR 結合從而起到穩定其mRNA 的作用。另有研究表明，HuR 還能調節細胞增殖過程中cyclin A 和cyclin B1 mRNA 的穩定性［7］。HuR 通過上調cyclin A和cyclin B1 mRNA 的半衰期來調控cyclin A 和cy?clin B1表達。這說明HuR可能在細胞增殖中發揮關鍵作用，至少部分是通過調控細胞周期依賴性的cy?clin A和cyclin B1 mRNA的穩定性。

HuR 保護mRNA 免于降解的確切機制尚不清楚，然而人們普遍認為，HuR與靶mRNA的結合可以阻止其他RBP或miRNA［與RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）或內在核糖體進入位點（internal ribosome enter site，IRES）相關］與其結合［8］，這些RBP 或miRNA 能夠將mRNA 重新募集到mRNA降解的位點，如外泌體或加工體［9-10］。

1.2 促進靶mRNA 翻譯 HuR 還促進幾個編碼參與疾病過程蛋白的靶mRNA 的翻譯，包括cyclin A2、胸腺素原α（prothymosin-α，Prot-α）、缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板應答蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）、p53、陽離子氨基酸轉運體1（cationic amino acid transporter-1，CAT-1）、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）、細胞色素C 等。目前還不清楚HuR如何促進這些靶mRNA 的翻譯，但有證據表明HuR促進XIAP 翻譯與XIAP 5′UTR 的IRES 相關。XIAP的胞內水平受多種不同的機制調控，但主要的調控機制還是在翻譯起始階段。XIAP mRNA 的5′UTR含有一個IRES 基序，當整體cap 依賴的翻譯受到損害時，該基序在細胞應激條件下驅動有效的XIAP mRNA 翻譯［11］。HuR 在體內外均能與XIAP 的IRES結合，并直接增強XIAP 翻譯［12］。有研究表明，HuR還可通過上調自噬相關蛋白ATG7和ATG16L1，促進自噬小體的形成來調節缺氧誘導的自噬［13］。此外，于文燕等［14］的研究證實，HuR 還可以與IκB-α mRNA 的3′UTR 特異性結合，通過促進IκB-α 的翻譯來調節其生物學功能，為進一步研究其在NF-κB 通路中發揮的重要作用提供了理論依據。

在HuR 上調翻譯表達的一些實例中也有報道HuR 誘導的從靶mRNA 中排除翻譯抑制子（其他TTR-RBP 或miRNA/RISC）的模型。促炎抑癌蛋白程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）在維持炎癥和腫瘤發生之間的平衡中起著重要作用。PDCD4 mRNA的翻譯被致癌的miR-21抑制。Poria 等［15］證明HuR 能與PDCD4 的3′UTR 相互作用，阻止miR-21 與其結合，進一步介導PDCD4的翻譯抑制。穩定表達miR-21 的細胞表現出較高的增殖能力和較低的凋亡率，而HuR 的表達則逆轉了這一趨勢。這為HuR在腫瘤細胞惡性增殖中的作用提供了依據。此外，Bhattacharyya 等［16］的實驗結果表明，miR-122 對CAT-1 mRNA 的抑制伴隨著它從細胞質加工體的釋放到募集于多核糖體。解除抑制需要使HuR 與CAT-1 mRNA 的3′UTR 競爭性結合。在這里與3′UTR 相互作用的HuR 充當修飾子，從而改變miRNA抑制基因表達的潛力。

1.3 抑制靶mRNA 翻譯 HuR 可抑制一小部分編碼疾病相關蛋白的靶mRNA 的翻譯。HuR 可與p27、胰島素樣生長因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）和凝血調節蛋白（thrombomodulin，TM）mRNA 的5′UTR 結合并抑制它們的翻譯，這種抑制作用被認為是由于這些5′UTR 中的IRES 被破壞所致。人類結腸癌細胞的數據顯示，HuR 通過對IRES介導的翻譯進行負面干擾來維持結構性降低的caspase-2 蛋白活性水平［17］。而caspase-2 在DNA 損傷誘導的細胞凋亡、細胞周期調控和維持基因組穩定性等方面起著獨特的調控作用，因此HuR/caspase-2 軸可能為腫瘤增敏治療提供一個新的靶點。HuR還被發現與Wnt5a 和c-Myc mRNA 的3′UTR 結合并抑制其翻譯。Wnt5a 被抑制的機制尚不清楚，但c-Myc 翻譯的減少與HuR 將let-7/RISC 復合物招募到c-Myc 的3′UTR 有關［18］。Mihailovich 等［19］在研究miR-17-19b 在c-Myc 驅動的淋巴瘤中的作用時發現，miR-17/20 下調檢查點激酶2（checkpoint kinase 2，CHEK2）導致HuR/RISC 向c-Myc mRNA 募集增加，從而抑制其翻譯，最終干擾體內腫瘤的生長。此外，最近有研究表明，環狀RNA 多腺苷酸結合核蛋白1（circular RNA polyadenylate-binding nuclear pro?tein 1，CircPABPN1）可以與HuR 結合，這種廣泛的相互作用抑制了HuR 與PABPN1 mRNA 的結合，從而部分或完全阻斷了PABPN1的翻譯［20］。

HuR最初被描述為一種穩定性的RBP，后來才逐漸被證明它可以調節靶mRNA 的翻譯，通常促進翻譯，但有時也會抑制翻譯。以上介紹了HuR的部分功能，但實際上其對靶mRNA的功能遠不止如此。HuR通過對特定靶mRNA 的轉錄后影響，參與細胞對應激、分化、增殖、凋亡、衰老、炎癥和免疫刺激的反應。

2 HuR功能的調節

由于HuR 參與了許多重要的生物學過程，其功能在多個水平上受到嚴格的調控，如蛋白質的豐富性和完整性、亞細胞定位和翻譯后修飾等。

2.1 HuR 豐度的調節 HuR 蛋白的水平有多種調節方式。關于HuR 表達的轉錄調控了解得比較少，目前只了解到HuR 的轉錄受到NF-κB 和Smad 蛋白家族的正調控。相比之下，HuR mRNA 和HuR 蛋白的豐度受到多種調控機制的影響。

2.1.1 HuR 自我調節 與許多甲狀腺素視黃質運載蛋白（transthyretin，TTR）-RBP 結合編碼自身的mRNA 的能力保持一致，HuR 也能與HuR mRNA 相結合。在HuR mRNA 的不同多聚腺苷酸變體中，HuR 被發現與末端含ARE 序列的長鏈HuR mRNA結合并使其穩定，這一作用與TTP 促進mRNA 衰變的作用相反。哺乳動物HuR蛋白能通過負反饋環自動調控其表達，通過負反饋環與自身的pre-mRNA 結合，增加含有不穩定ARE 序列的長鏈mRNA 的表達［21］。HuR 與HuR 3′UTR 的結合也增加了HuR mRNA 的胞質輸出。當這種蛋白質的核質分布保持相對恒定或在細胞周期中經歷程序性可逆波動時，這種機制可以確保HuR動態平衡［21］。

2.1.2 miRNA調節HuR HuR mRNA通常是miRNA的靶點［22］。Al-Haidari 等［23］的研究表明，miR-155-5p基因敲除降低了結腸癌細胞的趨化性和HuR的胞質表達。進一步研究表明，miR-155-5p 通過與HuR mRNA 3′UTR 處的ARE 位點結合而對結腸癌細胞中HuR mRNA 水平、翻譯及遷移起到正向調節的作用，提示靶向miR-155-5p和（或）HuR 可能是有效的抗結腸癌轉移的治療策略。另有研究表明，miR-519 靶向HuR mRNA 并抑制其翻譯［24］，從而闡明了RBP 被miRNA 所調控的機制。雖然大多數miRNA 與靶mRNA 的3′UTR 相互作用，但miR-519似乎主要通過與HuR mRNA 的編碼區結合而發揮作用。miR-519介導的HuR 豐度降低反過來又降低了一些HuR 靶mRNA 的表達，并顯著抑制了細胞增殖。miR-125a也與HuR 3′UTR 相關，同樣通過抑制HuR 翻譯來抑制HuR 的產生。在乳腺癌細胞中，miR-125a 過表達促進了細胞凋亡，抑制了細胞增殖和遷移［25］。

2.1.3 HuR 泛素化 中度熱休克時，HuR 蛋白水平短暫下降。這種減少與HuR 在Lys182 位點的泛素化有關，隨后是蛋白酶體介導的蛋白水解［26］。β-TrCP1 是靶向HuR 降解的泛素E3 連接酶［27］。Lan等［28］揭示了OCC-1（一種lncRNA）增強β-TrCP1 與HuR 的結合，使HuR 易于泛素化和降解，從而降低HuR 及其靶mRNA 的水平，包括與癌細胞生長直接相關的mRNA。熱休克后HuR 的瞬時降解可通過HuR的磷酸化來拮抗相關的mRNA。

2.2 HuR定位的調節 雖然HuR主要定位于核內，但相較于其在細胞質內的功能，HuR 的核功能除了在pre-mRNA 剪接中的作用有些許了解外，在很大程度上是未知的。HuR 發揮其對mRNA 的功能通常需要從細胞核移位到細胞質［29］。HuR 的鉸鏈區含有一種特殊的穿梭序列，稱為HuR 核質穿梭序列（HuR nucleocytoplasmic shuttle sequence，HNS），這使得它能夠在細胞核和細胞質之間穿梭。在受到壓力（例如低氧應激［30］）時，HuR 會向細胞質轉移，來增強特異性mRNA 的穩定性。臨床上已經證明HuR 細胞質定位與許多癌癥的不良臨床預后相關。HuR 穿梭是由關鍵殘基的翻譯后修飾控制的，但穿梭激活的確切機制仍有待了解。體外研究表明，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族PKCα 和PKCδ 的磷酸化能調節HuR 的核質穿梭能力［31］。然而，在不同的系統中，HuR 的細胞質轉位由p38 MAPK 激活負責。例如，在心室肌細胞中，用苯腎上腺素和血管緊張素II 處理導致HuR 細胞質轉位，該轉位可被SB203580（p38 MAPK 抑制劑）阻斷，但不被白屈菜紅堿（PKC抑制劑）影響［32］。

2.3 HuR 的翻譯后修飾 HuR 在不同殘基上被一些激酶磷酸化，或被輔激活物相關精氨酸甲基轉移酶1（coactivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM1）甲基化，影響HuR 的亞細胞定位和（或）它與靶mRNA 的相互作用。有研究表明，PKC 可激活不同HuR 結構域的磷酸化，協調其RNA 與攜帶ARE 的mRNA 的結合。在人結腸癌細胞中觀察到的PKCδ 在Ser318 處的組成型HuR 磷酸化與HuR 同其靶mRNA 的結合增加及隨后某些腫瘤相關基因（包括COX-2 和cyclin）的表達在功能上相關［33］。用藥物抑制PKC 活性，除了減少Ser318 處的HuR 磷酸化外，還對高細胞質HuR 豐度有很強的抑制作用［18］。因此，高組成性HuR磷酸化可能是在大腸癌、早期腺瘤或炎癥性腸病患者組織標本中觀察到病理性細胞質HuR水平增加的原因。

3 HuR在HCC發生發展中的作用

肝癌是世界范圍內一種常見的惡性腫瘤，每年導致超過70 萬人死亡。HCC 是原發性肝癌的主要類型。HCC 的病因與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、肝硬化、酒精中毒和非酒精性脂肪肝等有關。手術切除是HCC 患者的主要治療手段。然而，由于HCC 侵襲性強并且癥狀出現較晚，大多數HCC 患者被診斷時，多為癌癥晚期，手術治療效果不佳［34］。由于腫瘤復發和轉移的頻率很高，HCC 患者的預后仍然很差，5 年生存率低于25%。因此，這些嚴峻的挑戰使得尋找新的HCC診斷生物標志物和有效的治療靶點變得非常迫切［35］。

在細胞質中，HuR 與數千個靶mRNA 中的ARE結合，其中包括參與多種致癌生物學過程的眾多mRNA。HuR與許多編碼蛋白質的mRNA結合，這些蛋白質可能參與實現一些腫瘤相關的主要表型：細胞增殖能力增強、細胞存活率增強、局部血管生成增加、逃避免疫識別、促進癌細胞入侵和轉移等。在許多類型的腫瘤中普遍觀察到細胞質中HuR蛋白水平升高，比如大腸癌、胰腺導管腺癌和非小細胞肺癌［36-37］。在大腸癌中，胞漿中HuR 蛋白的增加與晚期腫瘤分期有關。更重要的是，在裸鼠異種移植模型中，HuR 的過表達促進了結腸癌細胞的生長。Al-Haidari 等［23］的研究首次證明，miRNA 可以直接調控HuR 依賴的結腸癌細胞遷移，并提示靶向miR-155和（或）HuR 可能是抑制結腸癌細胞轉移的有效途徑。由于HuR 主要在核內，要移位到細胞質中需受其核質穿梭序列和一些蛋白的調控，這對其致癌功能可能是重要的。因此，探究HuR 在HCC 發生發展中的作用可能為找到新的治療靶點提供策略。

3.1 HuR 穩定靶mRNA 的功能與HCC HuR 的致癌作用主要歸因于它與細胞質中與腫瘤相關mRNA的結合和穩定。眾所周知，Wnt 通路的異常激活在HCC中很常見。Lai等［38］發現了促進纖維化與腫瘤進展的Wnt-硬脂酰輔酶A 脫飽和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD）-低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）正反饋環，并表明HuR在該循環中的重要作用。在肝星狀細胞和肝癌起始干細胞樣細胞中，Wnt效應器β-catenin增加了SCD 依賴于甾醇調節元件結合蛋白1的轉錄，而β-catenin反過來又被SCD產生的單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）穩定。這一循環需要MUFA 抑制RAS 相關核蛋白1與轉運蛋白1 的結合，減少HuR 的核輸入，提高HuR胞漿水平，進一步增強其穩定LRP5和LRP6 mRNA的能力，從而促進小鼠的肝纖維化和HCC發生。

m6A 修飾涉及多種生物過程，包括腫瘤發生［39］。最近Chen 等［40］在研究Wilms 腫瘤1 相關蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）在HCC 中顯著上調并促進HCC 發展的作用機制時，發現WTAP 通過介導m6A 修飾導致了ETS 原癌基因1（ETS proto-on?cogene 1，ETS1）的表觀沉默，隨后證實ETS1在HCC中通過HuR 參與穩定ETS1 mRNA 而使其成為抑癌基因發揮作用，即WTAP 引導的m6A 修飾通過HuRETS1-p21/p27軸促進HCC的進展。

3.2 HuR 促進靶mRNA 翻譯的功能與HCC 已有研究表明，自噬是癌細胞的一種生存過程，抑制自噬是腫瘤治療的策略之一。雖然自噬在HCC中的作用仍不完全清楚，但自噬調節基因的改變，如ATG5、ATG6 和ATG7，會影響HCC 的發展。Ji 等［41］探究了HuR 在自噬小體形成中的調節功能。他們觀察到HuR沉默導致肝癌Hep3B 細胞和人胎肝細胞LO2 細胞自噬小體形成和自噬通量的抑制，并確定ATG5、ATG12 和ATG16 mRNA 是HuR 的直接靶點。HuR過表達可能通過促進ATG5、ATG12 和ATG16 mRNA的翻譯而參與肝癌細胞自噬的功能障礙。因此，嚴格控制細胞內的HuR水平對細胞內穩態至關重要。

3.3 HuR 抑制靶mRNA 翻譯的功能與HCC 已知葡萄糖代謝重編程是腫瘤的一個標志。為了在低氧環境中有效增殖，癌細胞會迅速地將其能量來源從氧化磷酸化調節為糖酵解［42］。在HCC 細胞中，缺氧可誘導HuR 特異性地結合初級miR-199a 轉錄本以阻斷miR-199a 的成熟（miR-199a 是一種強大的War?burg 效應抑制劑），即HuR 將缺氧與Warburg 效應聯系起來，從而促進了HCC的發展［43］。

此外，最近研究者也發現了HuR 與肝纖維化和肝硬化的關系［44］，這增加了HCC發生的風險，進一步說明HuR在HCC發生發展中的重要作用。

4 結語

近年來，RBP 已經成為分子生物學研究中的一個新焦點。作為一種RBP，HuR 的生物學功能以及在炎癥、腫瘤等病理過程中的作用機制已逐漸被發現，但迄今為止研究者對HuR 在HCC 方面的研究還不夠透徹，HuR 對HCC 發生發展和患者預后的影響以及在臨床上的應用等，仍是我們未來需要不斷探究的問題。