調控PTEN表達和活性的研究進展*

祁閃閃，楊 李，盧文婕，孫 鳴，宋 娜，陳 智，熊 昊

（華中科技大學同濟醫學院武漢兒童醫院血液腫瘤科，湖北武漢 430015）

人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）是一個經典的抑癌基因，位于染色體10q23.3，其編碼區含有1 209個堿基，編碼一個含有403 個氨基酸的蛋白。PTEN 蛋白含有4 個重要的功能區域：（1）N末端結構域，是PTEN蛋白N端的32個氨基酸組成的短肽，含有核定位序列；（2）催化結構域，由第7～185位氨基酸殘基在內的179個氨基酸組成，負責PTEN 的去磷酸化活性；（3）C2 結構域，由第186～351位氨基酸殘基在內的186個氨基酸組成，主要介導PTEN蛋白插入和錨定到脂質雙分子層；（4）尾區，包含第352～403 位氨基酸殘基在內的肽段，該區域富含絲氨酸和蘇氨酸，參與調控PTEN 的穩定性和磷脂酶活性。PTEN 尾區最后4 個（第400～403 位）氨基酸即ITKV，被稱為PDZ 結合基序（PDZ-binding motif，PDZ-BM），這一肽段介導PTEN與含有PDZ結構域的蛋白的相互結合。

PTEN 的氨基酸序列決定了其可以在胞漿和胞核之間動態穿梭的特性。而胞漿的PTEN 和胞核的PTEN 在腫瘤抑制方面扮演著不同的角色。胞漿中的PTEN 通過去磷酸化作用，將磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）轉化為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphati?dylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2），從而拮抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）通路的活性。因此，胞漿PTEN 的丟失可以導致PIP3 的累積并激活下游通路，促進細胞的存活、生長、增殖、代謝和遷移［1-2］。而胞核PTEN 的磷脂酶活性對維持染色體的完整性是必須的［3］。胞核PTEN 位于著絲粒附近，與著絲粒蛋白C（centromere protein C，CENP-C）協同作用，作為在有絲分裂時染色體分離所需動粒的重要組分，維持染色質的穩定性［3］。最近的研究表明，PTEN 的PDZ-BM 與腫瘤抑制蛋白DLG1（disc large homolog 1）/驅動蛋白EG5（kinesin EG5，EG5）直接的相互作用可調節紡錘體極體的組成和運動。PDZBM缺乏的細胞傾向于出現染色體的錯配，而且PDZ-BM缺失的小鼠易患淋巴瘤和乳腺癌［4-5］。

與一些經典的抑癌基因需要完全缺失才能誘發癌癥的現象不同，PTEN 功能的部分丟失便可對腫瘤的發生和發展產生巨大的影響。在本文中，我們將對近些年來已發現的調控PTEN 表達水平和酶活性的轉錄前與轉錄后調控機制進行概述。

1 PTEN蛋白翻譯后修飾調節

PTEN蛋白C端360-385肽段絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化可以增加PTEN 的蛋白穩定性或降低PTEN 的磷脂酶活性。目前已經發現有10 多種胞內激酶可以直接對PTEN 進行磷酸化。其中，酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）和糖原合成酶激酶3β（glyco?gen synthase kinase-3β，GSK-3β）是重要的兩個磷酸激酶，分別對PTEN 的S380-S385（集簇Ⅰ）和S361-S370（集簇Ⅱ）兩個肽段進行磷酸化。在集簇Ⅰ中，磷酸化的順序為S385＞S380＞T383＞T382；在集簇Ⅱ中，磷酸化的順序為S370＞T366＞S362＞S361＞T363。這些位點的磷酸化掩蓋了PTEN 蛋白N 端的催化結構域與C 端的C2 結構域分子內的相互作用［6-8］。將常發生磷酸化的5 個位點T366、S370、S380、T382 和T383 替換為丙氨酸可明顯使PTEN 的半衰期降低6倍［9］。與之類似，PTEN 整個C 端的截短也可明顯降低其穩定性［10］。這可能是因為PTEN 蛋白C 端的磷酸化使其呈現出一種閉合狀態，而保護了PTEN蛋白對水解敏感的部位。雖然上述的磷酸化可以增加PTEN 蛋白的穩定性，但S361/S380/T382/T383 或S385 的磷酸化卻可以降低PTEN 對底物PIP3 的去磷酸化活性［11-12］。總的來說，PTEN 的磷酸化調控機制部分解釋了：為什么在一些急性T 淋巴細胞白血病中，即使白血病細胞高表達非突變的PTEN，PI3KAKT信號通路仍處于高激活的狀態［13］。

雖然磷酸化PTEN 的激酶對調控PTEN 發揮著重要的作用，但是使PTEN去磷酸化的磷脂酶也有同等重要的作用。據報道，PTEN 可以通過其去磷酸化的活性對自身的T366 位點進行去磷酸化［14］。其他的磷脂酶，例如蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）可以被N-Myc 下游調節基因2（N-Myc downstream regulated gene 2，NDRG2）招募，對PTEN進行去磷酸化［15］。在T 淋巴細胞白血病細胞中，經常由于NDRG2 的低表達而使PTEN 在S380/T382/T383殘基磷酸化水平增加，進而增強PI3K-AKT信號通路的活化［15］。

PTEN 與多數蛋白類似，其賴氨酸殘基的單泛素化可調節蛋白的功能，而賴氨酸殘基的多泛素化則介導蛋白的蛋白酶體降解。PTEN 蛋白賴氨酸殘基的泛素化集中在N 端。據報道，K13 或K289 的單泛素化以及K254的類泛素化都可以促進PTEN 的胞核轉移和駐留［16-17］。NEDD4-1（neural precursor cell ex?pressed，developmentally downregulated 4-1）和X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis pro?tein，XIAP）是PTEN 單泛素化E3 連接酶［18-19］；E3 連接酶活化STAT 蛋白抑制物χα（protein inhibitor of activated STAT χα，PIASχα）則負責PTEN 的類泛素化［20］；而負責PTEN 去泛素化的是皰疹病毒相關性泛素特異性肽酶（herpesvirus-associated ubiquitin-spe?cific peptidase，HAUSP）［21］。PTEN 上述賴氨酸位點的去泛素化促進PTEN從胞核向胞漿轉移［21］。

PTEN 是一個相對較穩定的蛋白，其半衰期長于12 h［10］。K13 和K289 的多泛素化與其蛋白酶體調節的降解密切相關。泛素特異性肽酶11（ubiquitinspecific peptidase 11，USP11）負責多泛素化PTEN 的去泛素化，使PTEN 免于蛋白酶體的降解。USP11缺失的小鼠易于發生PTEN 相關的腫瘤［22］。目前，以E3 泛素連接酶為靶點的藥物正在被研究，以期通過抑制PTEN 的降解，上調PTEN 的蛋白水平，用于人類腫瘤的治療。

2 PTEN mRNA的調節

在多種腫瘤中，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是促進PTEN mRNA 降解的重要機制。有多種miRNA 可以結合在PTEN 的3′-UTR，其中最重要的一個是miR-21。miR-21 在人腫瘤中常高表達，而且可以直接靶向PTEN 的mRNA，負性調節PTEN的蛋白水平，進而促進細胞的增殖和侵襲［23］。其他的miRNA，例如miR-23a［24］、miR-26a［25］、miR-92a［26］、miR-130a［27］、miR-205-5p［28］和miR-221［29］也可以負性調控PTEN 的蛋白表達，激活PI3K-AKT 信號通路而促進腫瘤的發生、發展和侵襲。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物中最常見的mRNA 修飾［30-31］。甲基轉移酶復合體，包括甲基轉移酶樣蛋白3（methyltransferase like protein 3，METTL3）和METTL14，負責將m6A 共價修飾到mRNA 上。目前，m6A 修飾對PTEN mRNA的調控尚不清楚。但是，有研究報道METTL3 可以調控包括PTEN在內的多種基因的表達［32］。而且，METTL3的缺失可以導致m6A 甲基化的PTEN mRNA水平降低，以及PTEN 蛋白表達下調。這提示m6A 甲基化或許參與PTEN表達的調控。

可變剪接（alternative splicing，AS）是常見的PTEN mRNA 轉錄后的加工修飾，增加了轉錄本的多樣性。PTEN 存在多種剪切異構體（splice variant，SV）。早期的研究在膠質母細胞瘤和前列腺細胞發現的兩種PTEN SV 分別是PTEN-Δ和PTEN-B［33］。這兩種PTEN SV 都有C 端的缺失，由于穩定性降低，降解迅速，所以幾乎沒有磷酸酯酶活性。近期研究提示，Cowden 綜合征的致病機制與PTEN SV 胚系異常有關，在部分患者中存在3、4 或6 號外顯子缺失的PTEN SV，導致PTEN 蛋白水平下調。但最近在腎細胞癌中的研究表明，PTEN-Δ 與全長的PTEN 類似，具有腫瘤抑制的作用，高表達PTEN-Δ的患者具有更好的無轉移生存期和總生存期［33］。PTEN-L 是最近發現的一種PTEN SV，包含了PTEN 所有的結構域，但在N 端額外有一段173 個氨基酸的可變翻譯區域（alternately translated region，ATR）［34］。PTEN-L 的ATR 包含了可變剪切位點的信號肽，這使得PTEN-L可以被分泌至細胞外。在人血漿和血清及人源性細胞的培養上清中都可以檢測到PTEN-L。PTEN-L 的ATR 還包含一個類似于細胞滲入性多肽的聚精氨酸基序，使得PTEN-L 能夠進入細胞。類似于胞內的PTEN，外源性的PTEN-L能夠下調PI3K通路，影響細胞在體外的存活。因為PTEN-L 能夠脫離供體細胞，并作用于受體細胞，所以在腫瘤微環境中，間質細胞PTEN的狀態可能會對腫瘤細胞PTEN的活性產生影響。PTEN-L 的旁分泌功能也許可以解釋之前存在的現象，即在體外PTEN的缺失對腫瘤細胞的增殖有明顯的影響，但是PTEN缺失的腫瘤細胞移植至小鼠體內時腫瘤的生長并不一定存在差異［35］。

可變聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）是PTEN mRNA 轉錄后修飾的另一種方式：通過在不同的APA 位點切割，然后添加polyA，豐富了PTEN轉錄本的多樣性。PTEN基因受APA調控的位點位于終止密碼子上游3 kb［36］、290 bp 及60 bp 處，可以導致PTEN 轉錄本的縮短［37-38］。有研究人員認為PTEN 3′-UTR 的縮短可以限制miRNA 的結合，從而增加PTEN mRNA的穩定性［39］。

3 PTEN的轉錄前調控

上述PTEN 的調控都是發生在轉錄后，而PTEN轉錄前的調控對PTEN的表達也發揮著重要的作用。據報道，多種轉錄因子可以正向或負向調控PTEN的轉錄。其中p53、表皮生長因子1（epidermal growth factor 1，EGF1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）可以結合在PTEN的啟動子上，上調PTEN 的表達［40-41］。與之相反，SNAIL、c-Jun 和NF-κB 可以下調PTEN 的表達［42-43］。而NOTCH1既可以上調也可以下調PTEN 的表達，這取決于NOTCH1是與著絲粒結合因子1（centromere binding factor-1，CBF-1）相互作用還是與MYC相互作用［44-45］。

PTEN啟動子的表觀沉默是PTEN基因失活的另一種方式。PTEN啟動子CpG 島的異常高甲基化存在于多種腫瘤中，包括乳腺癌、結腸癌、多發性骨髓瘤和胃癌等［46-50］。同時，PTEN的轉錄也受到組蛋白乙酰化的調控。有報道稱，轉錄因子SALI4 可以通過招募具有染色質重塑作用的ATP 酶和具有組蛋白脫乙酰活性的核小體重構及脫乙酰酶（nucleo?some remodeling and deacetylase，NuRD）復合體至PTEN的啟動子上，抑制PTEN的轉錄［51］。

4 恢復PTEN的治療措施和臨床轉化前景

恢復PTEN 功能的傳統臨床研究著重于拮抗PI3K 信號。這類研究的靶點涉及整個PI3K 通路的激酶，包括受體酪氨酸激酶、PI3K、AKT 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）［52］。而最近的研究將重點轉移到PTEN缺失對基因組穩定性和使用PARP 抑制劑靶向PTEN缺失的腫瘤上［53］。在大量體外和體內的臨床前研究中，PTEN基因的恢復能夠降低一些腫瘤細胞系細胞的凋亡［54-55］。然而這些模型依賴于PTEN基因的基因重組，目前尚不能在臨床上實施。

5 小結

本文對調控PTEN 表達和活性的機制進行了總結。最近幾十年中，相關機制有了許多新的發現。但是目前這些調控機制尚未能為臨床治療提供很大幫助。不限于，但可能存在以下的原因造成了這一現象：（1）異質性大：在不同類型的腫瘤中，甚至是同一種腫瘤的不同患者中，調控PTEN的機制都可能存在很大的異質性；（2）機制定位難：PTEN 是一個穿梭在胞漿和胞核的蛋白，在不同部位發揮著不同的抑癌作用，但目前尚無有效的手段可以迅速對患者PTEN 調控機制異常進行定位；（3）靶向性差，調控PTEN的上游通路往往同時調控著其他靶蛋白，而且PTEN 亦調控著下游眾多靶基因，形成復雜的網絡，導致藥物很難有準確的靶向性。總之，對這一關鍵抑癌基因調控機制的全面了解或許可以指導開發更多有效的恢復PTEN抗腫瘤活性的藥物。