小鼠植入后胚胎體外延時培養體系的應用進展

邵紅蓮譚 韜

(1.昆明理工大學生命科學與技術學院,昆明 650500；2.昆明理工大學云南中科靈長類生物醫學重點實驗室,昆明 650500)

哺乳動物植入后胚胎發育的相關機制是發育學領域的關注熱點,小鼠是最易獲得且最具特征的哺乳動物胚胎發育模型。 哺乳動物的早期胚胎發育經歷:受精卵→2-細胞→4-細胞→8-細胞→桑椹胚→囊胚→原腸胚幾個階段,植入后早期胚胎發育是指囊胚由輸卵管進入子宮著床并繼續發育的過程[1-5]。 小鼠胚胎體外培養體系的成功建立,可以作為一個深入研究小鼠植入后胚胎發育的相關機制平臺,也可以作為其他哺乳動物胚胎體外培養體系的建立及優化的參考依據。

現階段已有較多小鼠植入前胚胎發育機制的相關研究,植入前胚胎發育過程的核基因組、轉錄組、蛋白表達變化等問題都得到了比較詳細的解答[6]。 Xue 等[7]研究發現,受精卵胚胎處于轉錄靜止狀態,其發育完全由母系提供的蛋白質和來自卵漿的RNAs 控制,2 細胞期才發生重要的基因激活。桑椹胚時期內細胞團(inner cell mess,ICM)和滋養外胚層(trophoblastic ectoderm,TE)分化形成囊胚的分子機制也較為詳盡[8-9]。

相較于眾多的植入前形態發生和信號通路的研究,植入期和植入后期的研究非常有限。 尤其是人類及非人類靈長類動物的胚胎,其植入期、植入后期的形態發生、轉錄組和表觀基因組的特異性調控都未得到系統的研究。 由于人類胚胎14 d 原則的倫理限制以及難以獲取胚胎,小鼠胚胎成為眾多基礎研究的常用胚胎模型。 小鼠胚胎的體外延時培養體系不僅能夠解釋植入過程和植入后的胚胎發生事件,更為探索高級哺乳動物體外培養體系建立基礎。 該篇綜述對小鼠植入后胚胎體外延時培養體系進行總結,并對更高等的哺乳動物的體外培養體系發展提供更好的思路。

1 普通培養體系

目前常用的體外培養體系(in vitroculture,IVC)可大致分為兩類:IVC1 與IVC2。 IVC1 用于滋養層細胞(trophoblast cells,TS)貼壁前的培養,IVC2用于TS 貼壁后的培養。 目前很多實驗室都在進行小鼠的體外延時培養,培養體系在不停的優化,但依舊不能獲得穩定的體系。

1.1 基于DMEM、Whitten 的體外培養體系

2011 年,Takaoka 等[10]使用 DMEM、Whitten 培養基培養 E5.0-E5.5 和 E3.7 胚胎。 首先在添加50%胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)和25 mm HEPES-NaOH(pH 7.2)的 DMEM 中恢復胚胎。 隨后將E5.0-E5.5 胚胎轉移到培養基中,該培養基由75%大鼠血清和25% DMEM 緩沖44 mM NaHCO3(pH 7.2) 組成。 將 E3.7 胚胎轉移到改良的Whitten 培養基中。 胚胎在35 mm 的玻璃底塑料培養皿中培養。

1.2 基于CMRL1066 的體外培養體系

2012 年,Morris 等[11]人為了研究小鼠植入后胚胎前后軸的形成,建立了一套體外培養體系。 在該體系中,IVC1 的基礎成分為 CMRL1066、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、雙抗(青霉素和鏈霉素)、胎小牛血清(fetal calf serum,FCS)等。 IVC2 基礎成分與 IVC1相同,但使用人臍帶血清(human cord serum,HCS)替代了FCS。 該培養體系使用了聚丙烯酰胺凝膠與玻璃結合,并覆蓋各種蛋白質涂層,以便能夠清晰地跟蹤前內臟內胚層的逐步發育。 但是凝膠制備的復雜性和HCS 分離難度使該方法難以廣泛應用,而且來源不同的HCS 可能會導致培養結果的不同。

1.3 基于Advanced-DMEM/F12 的體外培養體系

2014 年,Bedzhov[12]團隊描述了一個支持小鼠胚胎發育至囊胚之后的體系,提供了一個新的分步培養方案,奠定了小鼠植入后胚胎體外延時培養體系的發展基礎。 在該研究中, 采用 Advanced-DMEM/F12 代替CMRL-1066,同時添加雙抗(青霉素和鏈霉素)、L-谷氨酰胺、β-雌二醇、孕酮、N-乙酰-I-半胱氨酸等成分。 為進一步降低HCS 的需求,他們還添加了ITS-X 和敲除血清替代品(KnockOut serum replacement,KSR)。 IVC1 與 IVC2 均基于以上成分,二者最主要的區別在于,IVC1 使用FBS 作為胚胎的營養成分,而 IVC2 使用 KSR 替代 FBS。該研究還采用了特殊的光學材料(ibiTreat μ-plates,eight-well)作為基質,在體外將小鼠囊胚培養到卵圓柱階段,體外培養的胚胎形態以及譜系標志物的檢測和正常體內E6.5 相同。

在該研究中,Bedzhov 等[12]還嘗試了兩種培養方法。 第一種方法從早期囊胚開始,去除透明帶后,囊胚可以附著在基質上,5 d 后發育成卵圓柱體；第二種方法是從晚期囊胚開始,在3 d 內分離出的附壁TE 形成卵圓柱體,通過這種方法可以觀察到以前隱藏的發育時期。 他們使用的培養體系可用于直接監測小鼠植入期胚胎譜系發生,胚胎生長等情況。 至此,小鼠胚胎體外延時培養體系已初見規模,能夠很好的支持眾多小鼠胚胎研究。

2 3D 培養體系

早在幾十年前,研究者就觀察到,細胞在活體內和培養皿中所處的微環境截然不同。 當細胞系嵌入3D 基質或標準組織培養板中時[13],細胞表現出顯著的不同形態和生長特征[14]。 自此,細胞培養技術的一個重要進展是引入了3D 培養系統。 與二維方法相比,3D 方法的一個主要優點是減少了細胞培養系統和體內環境之間的差距,顯示出更接近復雜的體內條件特征[15-17]。 在傳統的2D 條件下,對分化、增殖和細胞功能非常重要的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分、細胞間相互作用都會丟失[18]。 在3D 培養系統中,未分化細胞的存活率也得到了提高,這對研究與環境相關的物理化學因素對胚胎細胞的影響是有幫助的。

3D 支架是用各種天然(膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、絲素蛋白、殼聚糖、甲殼素、纖維蛋白、纖維蛋白原等)和合成聚合物制成的,同時也包括一些公認的天然和合成物質的混合物。 常用的3D 支架材料有瓊脂糖、膠原、纖維連接蛋白、明膠、層粘連蛋白和卵黃蛋白。 這些復合材料在孔隙率、纖維、滲透性和機械穩定性等物理特性方面模擬天然ECM。微結構增強了胚胎中粘附細胞的生物物理學和生物化學相互作用,使其在體外更好的表達相應的基因。 3D 基質為胚胎增殖、分化和分泌細胞特異性ECM 提供了一個生物活性環境[19]。 以下介紹了常用3D 基質及其在胚胎培養當中的用途。

2.1 基質膠(matrigel)

Matrigel 在干細胞領域已經有了充分的應用,在胚胎培養當中也有所嘗試。 Bedzhov 等[20]使用Matrigel 培養E3.5 胚胎的ICM。 該研究將單個ICMs滴入ibiTreat 顯微術塑料m 板中的基質凝膠中,37℃孵育2～3 min,直至基質凝膠凝固。 然后用加熱過的IVC1 培養基填充培養皿。 在以Matrigel 為基質的3D培養體系當中,TS 的發育更加接近于體內的狀態,可以在一定程度上模擬體內的著床過程。

2.2 聚丙烯酰胺膠

Niu 等[21]評估了與玻璃結合并覆蓋各種蛋白質涂層的聚丙烯酰胺水凝膠在3D 胚胎延時培養體系中的使用。 在該研究中,首先通過改變 N′N′-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酰胺的比例來優化聚丙烯酰胺水凝膠的表面硬度,其次使用了不同的蛋白質涂層。 采用I 型大鼠尾膠原涂層時,87%(13/15)的胚胎可附著在基質上,38%(5/13)的胚胎可發育成卵圓柱。 相比之下,層粘連蛋白或纖維蛋白-布朗寧與膠原結合使用時,80%(12/15)的胚胎可以附著,41%(5/12)的胚胎可形成卵圓柱。 這些胚胎發育出正確的形態和外胚層(epiblast,EPI)、TE 和原始內胚層(primitive endoderm,PrE),并且表達相應的組織標記基因。

2.3 3D 培養體系在其他哺乳動物中的應用

Shao 等[22]基于人多能干細胞(pluripotent stem cells,PSC)的模型,建立了稱為植入后羊膜囊胚狀體(post-implantation amniotic sac embryoid,PASE),它能夠概括圍繞羊膜囊發育的多個植入后胚胎發生事件。 在沒有母體或胚胎外組織的情況下,PASE自組織形成一個具有不對稱羊膜EPI 的上皮囊腫,類似于人類羊膜囊。 在進一步的發育過程中,PASE以SNAI1 依賴的方式啟動一個類似于后原條發育的過程。 此外,他們還發現到非對稱BMP-SMAD 信號與PASE 的發展同步,并證實 BMP-SMAD 的激活/抑制調節了PASE 的穩定發展。 該研究為小鼠胚胎體外延時培養提供了新的思路,即構建3D 的培養體系,為胚胎著床及著床后的發育提供可能的條件。 他們采用3D 培養體系來培養植入后人羊膜囊,其在8 孔板底部鋪有一層Matrigel,且在日常培養基中添加了ECM。 Matrigel 能夠向EPI 細胞提供極化信號,胚胎干細胞在Matrigel 內培養后能夠形成類似體內胚胎花環的EPI 結構,凋亡細胞數量也少于一般的二維培養[22]。

3D 培養體系在體外通過細胞外基質構建類體內環境,有效促進了哺乳動物胚胎在體外的發育過程,進而促進胚胎前后軸形成動力學、胚胎滋養巨細胞與子宮內膜相互作用等問題的理解[23]。 但3D 體系仍然不夠成熟,不能夠完全模擬小鼠胚胎體內著床以及著床后的進一步發育。 尋找更合適的3D 體系材料及其構建方法、并將其與已知的維持胚胎的培養體系結合是該領域的重點研究方向。 現如今,3D 打印技術逐漸成熟,能夠建立更加精細的結構,該技術將來可以被應用于小鼠胚胎體外延時培養的3D 體系的建立,也有可能進一步為非人類靈長類動物和人類的胚胎的體外培養提供技術支持和研究基礎。

3 培養體系添加物

有研究者報道了小鼠囊胚到卵圓柱轉變過程中的關鍵形態發生事件,這些步驟將簡單的EPI 細胞球轉化為杯狀上皮細胞[12]。 Copp[24]揭示了體外囊胚著床后,TS 與ECM 的粘附強度隨時間而發生變化,這限制了極性細胞進一步的體外發育,從而導致卵圓柱的形成。 Bedzhov 等[20]人發現,胚胎外細胞系分泌的基底膜成分為PSC 提供了極化信號。這導致EPI 整體重組為玫瑰花狀結構,并伴隨管腔發生。 除了3D 體系,胚胎發育過程中,胚胎外細胞系分泌的細胞因子也會決定胚胎發育的質量。 因此體外培養體系中的各類添加物對胚胎發生也發揮重要作用。

3.1 細胞因子

在囊胚(E3.5)中三種不同的細胞系TE、ICM中的EPI 和PrE 發育過程中,許多關鍵的譜系因子,如CDX2、POU5F1 和SOX17,分別在小鼠胚胎發育過程中表現出保守表達。 在小鼠體內胚胎發育過程中,成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)信號和隨后的細胞內絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑激活EPI 和PE 細胞的分化,最終分別產生胚胎固有細胞和卵黃囊。 在小鼠胚胎培養過程中抑制 FGF/MAPK 信號可增加 ICM 內表達 NANOG 細胞的比例,FGF 受體上調可導致ICM 細胞轉化為GATA6陽性PE 前體。 IGF1 受體、IGF1 和胰島素受體分別在人 PE 和 EPI 中表達,通過磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)/mTOR,可以維持胚胎內細胞干性的通路,如對PE 發育有重要作用的FGF 通路[25]。 在小鼠胚胎培養基中,添加IGF 和EGF 有利于胚胎從透明帶孵出。 對小鼠胚胎研究表明,TGF-α 和EGF 能分別通過自分泌作用和旁分泌作用促進囊胚腔的擴張膨大。 IL-1、IL-6、CSF-1 以及 TNF-α 等生長因在人早期胚胎植入過程中擔任不同的角色,最終促進胚胎成功著床以及后續的胚胎發育。 Niu 等[21]在體外建立了一個培養體系,在人胚胎培養體系的基礎上進行優化,能夠將高級哺乳動物食蟹猴的胚胎延時培養至20 d,獲得的胚胎能夠出現譜系分化、胎盤形成、羊膜囊和卵黃囊成腔化以及原始生殖細胞分化等哺乳動物胚胎發育過程中的關鍵事件。 他們通過ROCK 抑制劑Y-27632 促進了猴胚胎的發育,減少胚胎內細胞的凋亡。 因此細胞因子及其作用通路是優化胚胎體外延時培養體系的重要研究方向。

3.2 激素及有機物

胚胎環境中的激素以及體內環境中的有機物質也對胚胎發育有著重要的作用。 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)在體內可以吸附于TS 表面,保護TS 免受母體淋巴細胞的攻擊。 體內hCG 的濃度也與囊胚發育質量有顯著相關性。 在體外,孕馬血清促性腺激素和hCG 的合用可以在一定范圍內增加小鼠胚胎的發育數量和發育率[26]。 雌激素也在小鼠早期胚胎發育過程中發揮重要作用,其在小鼠胚胎的體外培養體系中都有添加。 ?；撬岷虴DTA 可以克服二細胞阻滯,一些氨基酸如谷氨酰胺也會參與蛋白質、DNA 的合成,成為胚胎發育最初48 h 內的重要能量來源,而且谷氨酰胺具有防止細胞氧化的功效,一些研究表明,在培養液中添加谷氨酰胺,可提高小鼠在體外的囊胚孵化率[27]。

4 單細胞轉錄組測序對胚胎發育的啟示

小鼠植入前胚胎體外培養體系較為成熟,能夠培養至原條出現階段。 但隨著囊胚的發育進行,胚胎內的細胞逐漸分化,所需求的信號分子也隨之發生改變。 這也對體外環境是否能夠支持不同細胞系的發育提出了更高的要求。 研究表明轉錄因子網絡的協同作用對于胚胎發育成功的譜系分離是必不可少的[28-31]。 對早期胚胎的單細胞轉錄組分析(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)給胚胎發育領域帶來了很多新的啟發[25]。 scRNA-seq 在不到10 年的時間里飛速發展,該技術能夠揭示胚胎內的每一個細胞各自的發育事件及其產生的變化,詳細研究特定基因和調控序列在發育中的作用。

4.1 胚胎發育的基因表達

Smart-seq2 技術的出現及優化為胚胎發育的單細胞轉錄組學提供了一個很好的平臺[32-34]。Mohammed 等[35]人通過對 E3.5 到 E6.5 小鼠胚胎進行scRNA-seq 來研究從著床期到早期原腸胚形成的調控環境,以探索從植入前到早期原腸胚早期的小鼠發育。 有研究者將該方法直接應用于E3.5 小鼠囊胚未分化ICM 中的單個細胞,發現存在兩個細胞群,一個具有PrE 表達,另一個具有多能性EPI 樣基因表達。 兩個群體間差異表達的基因在胚胎中E4.5 在形態分化的PE 和EPI 中得到了很好的保存,表明該方法成功地檢測到了表面上同質的細胞群體在單細胞水平上細微但本質的差異[36-37]。 為了建立小鼠囊胚ICM 內EPI 與PrE 譜系分離的圖譜,Ohnishi 等[38]描述了單個ICM 細胞的基因表達譜。 這項研究提出了一個模型,即ICM 中細胞基因的表達水平出現隨機變異,且彼此獨立,隨后通過一系列信號通路增強支持了ICM 譜系分離。 眾多胚胎scRNA-seq 是胚胎內細胞群體的鑒定強有力的工具,為細胞命運的溯源提供證據。

4.2 胚胎發育的細胞命運圖譜

體內哺乳動物細胞分化軌跡的全面描繪代表胚胎發育過程中基因表達變化的基線,其可用于再生醫學的優化體外分化方案的參照[39]。 Scialdone等[39]通過單細胞轉錄組分析小鼠胚胎早期中胚層分化的問題。 傳統的多細胞DNA 分析的實驗方法依賴于細胞數較多的樣本,不適合胚胎早期譜系多樣性的研究。 為了解決這個問題,他們使用scRNA-seq 研究了1205 個中胚層單細胞向造血系統的分化過程,涵蓋了從E6.5 早期原腸胚形成到E7.75 原始紅細胞生成的時間過程。 在E6.5 小鼠胚胎中,位于PrE 和EPI 交界處的細胞經歷上皮-間充質轉化。 隨后,細胞發生遷移進而獲得不同的細胞命運,或圍繞著EPI,或進入PrE 形成卵黃囊、臍帶和胎盤。 細胞命運圖譜顯示,成熟組織,如血液和心臟,起源于原腸胚前成纖維細胞的特定區域,但仍然不清楚胚胎中眾多細胞的命運是如何決定的[40]。

Pijuan-Sala 等[40]報告了在受精后 6.5 ～ 8.5 d的九個連續時間點收集的來自小鼠胚胎的116,312個單細胞的轉錄譜。 構建了從多能性向所有主要胚胎譜系的細胞分化的分子圖譜,并探討了內臟和原條衍生、內胚層融合的復雜事件[39]。 Cao 等[41]分析了在妊娠9.5～13.5 d 之間的61 個胚胎大約200萬個細胞的轉錄體。 由此產生的“小鼠器官發生細胞圖譜”(MOCA)提供了這一關鍵時期發育過程的全局視圖[41-42]。 scRNA-seq 為追蹤胚胎發育過程的所有細胞命運提供了可能,而且該領域還需要更深入的研究去完善其他哺乳動物胚胎譜系分化圖譜。

4.3 其他哺乳動物胚胎發育的單細胞測序研究

與此同時,眾多研究者對高級哺乳動物的胚胎也進行了單細胞轉錄組的研究,探索胚胎發育的復雜機制。 EPI 是哺乳動物所有體細胞和生殖細胞的起源。 為了探索人類和靈長類多能性的個體發育,Nakamura 等人[43]對食蟹猴(Macaca fascicularis)植入前和植入后的EPI 進行了全面的scRNA-seq。 結果表明,在囊胚發育過程中,食蟹猴EPI 在著床過程中發生了重要的轉錄組變化。 該研究不僅揭示了EPI 發育的差異性和一致性,而且確定了關鍵物種間多能性譜的發育坐標,為更好地建立人胚胎的培養體系提供了線索。 Zhou 等人[44]結合體外培養的胚胎發育和scRNA-seq,系統分析了來自人的65 個移植前后胚胎的8000 多個單個細胞。 轉錄組數據的無監督降維和聚類算法顯示了EPI、PrE 和TE 譜系的逐步植入路徑,表明胚胎在植入過程中為著床于子宮內膜做好了充分準備。 該研究提供了對調節人類胚胎植入的復雜分子機制的理解,并有助于推進未來對早期胚胎發育和生殖醫學的理解。 眾多的測序研究結果揭示了小鼠、高級哺乳動物以及人胚胎發育過程中的復雜路徑,同時其詳盡的轉錄組信息為體外延時培養獲得的胚胎發育譜系提供了很好的參照標準,也為解析發育過程的分子機制提供了有力的支持。

5 結論與展望

胚胎是生命的起源,理解胚胎的發育歷程有助于研究高等動物的發育過程。 小鼠胚胎以其哺乳動物的胚胎特性和較短的發育時間等優勢,成為了很好的胚胎研究的模型。 猴胚胎、人胚胎的植入發育研究都是建立在小鼠胚胎的模型上來開展的。建立體外延時培養的小鼠胚胎體系,有助于我們更好的理解哺乳動物在著床后所經歷的事件,揭示胚胎發育的過程。 高級哺乳動物以及人胚胎的延時培養研究能夠反哺小鼠胚胎體外延時培養體系的有效建立。

總之,植入后胚胎體外培養這個領域在胚胎發育過程的研究中是至關重要的。 目前針對胚胎的體外培養技術還存在不足,需要更多的研究投入。未來的研究需要更多地理解胚胎發育的機制以及發育過程中的事件,這可以為生殖醫學等相關領域提供相應的基礎,也可以幫助我們理解生殖醫學中的多種問題,例如胚胎受孕后的流產、胚胎與子宮內膜的交互作用以及移植胚胎吸收等相關事件。