MPTP 誘導C57BL/6 小鼠帕金森模型的制備和評估

林 臻陳洪志趙 航劉 輝許妍妍劉海巖張 浩

(吉林大學基礎醫學院人體解剖學系,長春 130021)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的中老年神經退行性病變,隨著人口老齡化的加劇,患病人口日益增加[1]。 其病理學表現為中腦紋狀體和黑質區域多巴胺能神經元進行性減少。 現有多種機理的動物模型可以模擬帕金森病的發生和進展,其中藥物誘發化學損毀模型以其簡便、快捷和較為經濟的優勢,成為廣泛應用的模型制備方法。 1-甲基-4 苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)經腹腔注射后可造成小鼠黑質和紋狀體區域多巴胺能神經元死亡,酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞和神經纖維減少,能夠模擬帕金森病的病理學表現,是一種常見的帕金森病模型誘導藥物[2]。 本研究擬通過對多種行為學表現的統計和評價,以及將行為學和形態學數據相互印證,初步建立一個可以通過行為學數據評估小鼠帕金森模型效果的簡便途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性 C57BL/6 小鼠 35 只,年齡 3 ～ 9 月齡,體重25～26 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。 飼養于吉林大學(基礎醫學院動物實驗中心)[SYXK(吉)2018-0001]。本實驗通過吉林大學基礎醫學院實驗動物倫理審查((2016 年)研審第 001 號),依據優化、減少、替代的3R 原則進行實驗設計。

1.2 主要試劑與儀器

MPTP 購自 Sigma 公司(貨號:MO896,中國)；亞克力材質行為學評估水箱、支架、曠場環境,由吉林大學人體解剖學系自行制作。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的制作

雄性C57BL/6 小鼠35 只隨機分為4 組,Ⅰ組為對照組5 只,給予計量為30 mg/kg 體重生理鹽水,持續7 d。 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為模型組,每組 10 只,分別給予計量為 35 mg/kg、30 mg/kg、25 mg/kg 體重的 MPTP 持續 7 d、8 d、10 d。

1.3.2 行為學檢測

(1)震顫麻痹評分

小鼠采用腹腔注射給藥,立即進行觀察,持續3 h。 評分標準為:0 分,與正常小鼠相似,無任何癥狀；1 分,出現豎毛、弓背、間斷性細小震顫,但活動自如；2 分,出現吞咽頻繁,頻繁性震顫,后肢張開,顫尾,活動逐漸受限；3 分,出現流涎、持續性震顫,四肢僵硬,活動受限；4 分,因全身麻痹而死亡。

(2)曠場實驗

給藥結束后第3 天開始,每天進行一次實驗,持續到第7 天。 采用亞克力材質50 cm×50 cm×50 cm方盒作為場地,均勻劃分為9 格,將小鼠放入曠場的正中格內,記錄小鼠三爪以上跨入鄰格的次數,觀察持續2 min。 評分標準為:0 分,跨入次數＞40 次；1 分,跨入次數為 31 ～ 40 次；2 分,跨入次數為 21 ～30 次；3 分,跨入次數＜21 次。

(3)爬桿實驗

給藥前3 d,每天進行一次爬桿訓練。 給藥結束后第3 天開始,每天一次測量,持續到第7 天。 將一直徑為2.5 cm 的塑料球固定于長50 cm、粗1.5 cm的亞克力桿頂端,纏上紗布以防打滑,然后將被測小鼠置于球上,記錄由球上爬至桿子底部所需時間。 評分標準為:0 分,爬桿時間＜4.01 s；1 分,爬桿時間為 4.01～8.0 s；2 分,爬桿時間為8.01～12.0 s；3 分,爬桿時間＞12.00 s。

(4)懸掛實驗

給藥結束后第3 天開始,每天進行一次實驗,持續到第7 天。 被測小鼠倒置懸掛,將兩前爪置于30 cm 長,25 cm 高水平電線中點,而后放開小鼠,記錄其抓握情況。 評分標準為,0 分,兩后爪均可抓住電線；1 分,一只后爪可抓住電線；2 分,兩只后爪均不能抓住電線。 如出現后爪反復抓取電線,間斷可抓住現象,可記為0.5 分。

(5)游泳實驗

給藥結束后第3 天開始,每天進行一次實驗,持續到第7 天。 小鼠放于40 cm×25 cm×16 cm 的水箱中,水深15 cm,水溫為(27±2)℃,記錄 3 min 內小鼠的漂浮時間。 評分標準為:0 分,漂浮 0 ～30 s；1分,漂浮 31 ～ 90 s；2 分,漂浮 91 ～150 s；3 分,漂浮151～180 s。

1.3.3 形態學檢測

全部行為學測試結束后第1 天,將小鼠麻醉后,37℃ 80 mL 生理鹽水灌流,4℃ 100 mL 4%甲醛固定,取出全腦。 4%甲醛外固定3 d,后進行常規石蠟包埋切片,厚度為4 μm。 石蠟切片分別進行HE 染色和免疫組化染色。

HE 染色:常規梯度乙醇脫蠟,PBS 沖洗3 min×3 次,經蘇木精染色、氨水反藍、伊紅染色后,脫水透明封片。 觀察小鼠紋狀體和黑質部分神經細胞的形態、數量和分布。

免疫組織化學染色:按照免疫組化檢測試劑盒步驟進行脫蠟、PBS 沖洗、3% H2O2抗原修復和血清封閉。 滴加一抗 TH 抗體(1 ∶300),4℃過夜后順次滴加試劑1(放大信號)和試劑2(二抗),各孵育15 min,PBS 沖洗后進行DAB 顯色、蘇木精復染,脫水透明封片。 觀察小鼠紋狀體和黑質部分TH 陽性細胞的形態、數量和分布。

1.4 統計學方法

所有實驗數據采用3 次測量取平均值的方式進行采集,使用SPSS 17.0 統計學軟件進行分析,用平均數±標準差()表示,不同組之間的差異用t檢驗比較分析,P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 震顫麻痹評分

腹腔注射MPTP 后5 ～30 min,小鼠相繼出現豎毛、弓背、間歇性小震顫,繼而可出現吞咽頻繁至流涎,后肢張開至四肢僵硬,震顫頻率逐漸增加,直至出現可持續數十秒的持續性震顫,60 min 后出現活動減低。 由于連續7～10 d 給藥,隨著體內積累藥量增加,小鼠出現活動減低現象時間逐漸提前,其他現象則漸不明顯,所以將第一次給藥評分作為震顫麻痹評分,各劑量組均數作為該組震顫麻痹評分。 可見對照組無震顫麻痹現象,隨單體次藥劑量增加,小鼠震顫麻痹現象加重。 各組震顫麻痹評分見表1。 給藥過程中有小鼠由于藥物反應死亡,后續檢測中30 mg/kg組和35 mg/kg 組實際測量分別為7 只、9 只。

2.2 曠場實驗

將曠場實驗連續測量5 d 的評分計算均數,作為單只受試鼠的評分,將各劑量組均數作為該組曠場實驗評分,具體結果見表2。 可見與對照組相比,給藥組的評分明顯增高,但30 mg/kg 組評分高于35 mg/kg 組。

2.3 爬桿實驗

通過預實驗發現,隨著不斷訓練,小鼠爬桿實驗完成時間會不斷變短,所以將停藥后第三天的爬桿實驗評分作為最終記錄評分,各劑量組均數作為該組爬桿實驗評分,見表3。 可見與對照組相比,給藥組的評分明顯增高,30 mg/kg 組與35 mg/kg 組無顯著性差異。

2.4 懸掛實驗

小鼠由停藥第6 天開始,懸掛實驗癥狀逐漸恢復,現將懸掛實驗停藥第3 ～5 天的評分計算均數,作為單只受試鼠的評分,將各劑量組均數作為該組懸掛實驗評分,具體結果見表4。 可見與對照組相比,給藥組的評分明顯增高,且隨著給藥劑量的增加,評分也隨之增高。

2.5 游泳實驗

將游泳實驗連續測量5 d 的評分計算均數,作為單只受試鼠的評分,將各劑量組均數作為該組游泳實驗評分,具體結果見表5。 可見與對照組相比,給藥組的評分明顯增高,但30 mg/kg 組評分高于35 mg/kg 組。

2.6 綜合統計

將各受試鼠的五項行為學測試評分加和,統計各組每只受試鼠行為學總得分。 見表6。

表1 震顫麻痹評分Table 1 Paralysis agitans score

表2 曠場實驗Table 2 Field test

表3 爬桿實驗Table 3 Pole test

表4 懸掛實驗Table 4 Traction test

表5 游泳實驗Table 5 Swim test

表6 綜合得分Table 6 Comprehensive score

2.7 形態學檢測

將各組小鼠分別取腦,對黑質和紋狀體分別行HE 和TH 抗體免疫組化染色,見圖1、圖2。

通過HE 染色,可以確定黑質區域神經元細胞以及紋狀體神經纖維的分布和形態。 進一步行TH抗體免疫組化染色,發現模型組在黑質區域存在多巴胺能神經元數量減低,紋狀體區域出現TH 陽性神經纖維數量減少的現象,能夠在形態學上認定帕金森模型制作成功。

圖1 黑質HE 和TH 抗體免疫組化染色Note.The upper line corresponds to the HE staining results of control group and 23 ～35 mg/kg groups,respectively.The next line corresponds to the TH immunohistochemical results of control group and 23～35 mg/kg groups,respectively.Figure 1 HE staining results and TH immunohistochemical results of the substantia nigra

圖2 紋狀體HE 和TH 抗體免疫組化染色Note.The upper line corresponds to the HE staining results of control group and 23 ～35 mg/kg groups,respectively.The next line corresponds to the TH immunohistochemical results of control group and 23～35 mg/kg groups,respectively.Figure 1 Figure 2 HE staining results and TH immunohistochemical results of the corpus striatum

3 討論

MPTP 自上世紀80 年代發現以來,已廣泛應用于帕金森化學損毀模型的制備。 其可以引起靈長類和嚙齒類動物腦內黑質和紋狀體區域多巴胺能神經元死亡,這與帕金森病的病理改變較為類似,由此也引起該動物模型產生與帕金森病相類似的形態學表現[3]。 TH 在多巴胺能神經元中含量較高,其水平能夠反應該神經元的位置和功能,因此,檢測黑質和紋狀體區域TH 表達的區域和變化,可以反映出多巴胺能神經元的位置和數量,由此判斷MPTP 誘導的帕金森模型的嚴重程度[4]。

帕金森病癥狀是由多種原因相互影響產生的,例如肌張力增強可導致協調障礙,進而引起運動減低。 而動物的行為學表現又同時受到客觀能力和主觀意愿的影響,所以單一的行為學實驗很難準確的反映出帕金森動物模型是否成功及其嚴重程度[5]。 本實驗選取了與帕金森病相關且較為常見和簡便易測的五種行為學評價方法[6-9],包括了運動能力、協調性、肌力、主觀意愿等各個方面,以期通過多個實驗來綜合評價,為分析行為學檢測和形態學指標的關聯性奠定基礎。

震顫麻痹評分是與給藥劑量直接相關的指標,多數研究對其以觀察現象為主,少有通過量表進行評分[10],這主要由兩個因素造成,一是隨著給藥的次數增加,小鼠活動減低時間前提并延長,很多癥狀趨于隱匿；二是相同給藥劑量情況下,小鼠表現較為相近,長時間觀察區分較為困難。 針對這兩個問題,本研究選取了多個給藥劑量,且以表現最為明顯的給第一次給藥作為觀察點,震顫麻痹評分的區分度較好。 給藥組與對照組差別顯著,且劑量依賴性明顯,增大劑量后,評分也隨之增高,但同時發現30 mg/kg 以上劑量,會出現由于不耐受藥物而產生的動物死亡,兩組累計死亡4 只,這與國外一般認為的45 mg/kg MPTP 劑量以內不會出現實驗動物死亡的報道不相符[11]。

曠場實驗、爬桿實驗和游泳實驗中,除與對照組存在顯著性差異外,25 mg/kg 的低劑量組與30 mg/kg 和35 mg/kg 的中高劑量組也存在較為明顯的差異。 同時30 mg/kg 和 35 mg/kg 間差別不明顯,反而出現個別評分與劑量相反的情況,說明給藥劑量存在一個較為明顯的閾值,超過該閾值后,這三個實驗的行為學表現沒有明顯的增強趨勢。此外由于小鼠對爬桿實驗適應性較強,反復測量會明顯降低評分[12],本研究在給藥前3 d 開始每天對小鼠進行訓練,使其適應爬桿環境,間隔7 ～10 d 的給藥期和2 d 的穩定期后,在給藥結束后第3 天直接測量爬桿實驗評分,力求避免小鼠適應性對爬桿實驗評分的影響。

有研究顯示懸掛實驗的穩定性較好,一般可以持續到給藥結束一到二周才會出現明顯的癥狀消退[13],本研究發現在懸掛實驗評分在第6 天即出現明顯降低,模型動物力量明顯升高,因此僅統計了停藥后3～5 d 的評分。 在每天評價中的三次測量基本得分一致,在停藥5 d 的跨度中變化也較小。懸掛實驗主要反應了小鼠的肌力情況,與對照組相比,給藥組有明顯的評分增高,而在給藥組內,三個劑量組也均有顯著差別,說明肌力隨給藥劑量增加而持續下降。 但是抓握能力下降也與協調性和精細運動障礙有關,所以此實驗仍有其他因素加入,不能認為僅反映肌力情況。

本研究將五個行為學實驗整合起來,統計綜合得分,進行組間對比,可見三個給藥組與對照組均存在顯著性差異,說明即使給予低劑量藥物,也能引起動物模型類帕金森病的行為學改變。 低劑量組與中高劑量組間也存在顯著性差異,說明給予中高劑量藥物會使此類行為學改變顯著增強。 但是中高劑量組間無顯著性差異則說明,給藥劑量存在某一閾值,給予超過閾值劑量的MPTP,行為學改變不會進一步出現顯著性增強,但會出現藥物致死現象。

以往研究中由于單一行為學評估手段的不穩定性,多采用形態學手段進行模型判定[3-5]。 這就要求必須抽樣處死一批造模動物進行判定,既增加了實驗的復雜性,也不能保證存活動物一定能夠達到模型成功標準。 本研究進行整合行為學評分與形態學表現關聯分析,以形態學結果為判定標準,進一步分析發現整合評分達到7.5 分以上的模型可以確定造模成功,6 分以下可以確定造模失敗,提示整合行為學評估手段對模型判定較以往單一行為學檢測方法更為準確,與形態學檢測結果一致性更強。 同時在總體趨勢上整合行為學評分較高的個體形態學表現也更為明顯,可以認為帕金森病嚴重程度較高,進一步可以對模型的嚴重程度進行簡單的劃分。

因此,本研究采用的整合行為學評分方法可以提高MPTP 誘導C57BL/6 小鼠帕金森動物模型制備標準及其以此動物模型為基礎的相關科學研究的科研數據的可靠性。 在今后的研究中,以此為切入點,增強模型穩定性,優化整合評估手段,可以使MPTP 誘導C57BL/6 小鼠帕金森模型的制備和評估更加簡便準確。