真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)的自噬機(jī)制研究

黃 劍馬曉彤張亞杰李麗靜韓 冬劉 佳

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長(zhǎng)春 130117)

心力衰竭又叫充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,CHF 是心臟無法滿足機(jī)體代謝所需要的血量進(jìn)而引起的以循環(huán)功能障礙為主要表現(xiàn)的臨床綜合征,包含身體多個(gè)方面改變,最終出現(xiàn)心功能失代償,出現(xiàn)心力衰竭的癥狀[1]。 CHF 屬于中醫(yī)證候中的心腎陽虛證,其具有本虛標(biāo)實(shí)的特點(diǎn),表現(xiàn)為脾氣虛、肺氣虛、腎氣虛和肝氣虛,以水停血瘀、陽虛水泛為發(fā)病機(jī)制,以上表現(xiàn)屬《傷寒論》中的真武湯證,應(yīng)以真武湯加以治療。 臨床研究表明真武湯可以輔助西藥進(jìn)行慢性心力衰竭治療,可以輔助西藥逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu),提高心臟供血能力,改善心力衰竭患者心功能[2-3]。 因此,本實(shí)驗(yàn)依據(jù)真武湯對(duì)心肌的保護(hù)作用,通過注射阿霉素建立心腎陽虛型心力衰竭大鼠模型,研究大鼠接受真武湯前后對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠行為體征、血流動(dòng)力學(xué)以及相關(guān)自噬過程中蛋白表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康2 月齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠70 只,體重260～280 g 購(gòu)自遼寧省長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)-2016-0001]。 甲狀腺切除手術(shù)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室[SYXK(吉)2016-0017]進(jìn)行。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及操作流程嚴(yán)格遵守3R 原則,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(20190051)。 動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室,室溫為25℃,相對(duì)濕度為50%～70%,飼喂大鼠維持飼料,自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

注射用鹽酸多柔比星(161108),購(gòu)置于山西普德藥業(yè)股份有限公司；芪藶強(qiáng)心膠囊(20160412),購(gòu)置于石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司；大鼠BNP、LA、CaN、TSH、T3、T4 試劑盒購(gòu)置于上海源葉生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗二抗去除液、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、Western 洗滌液、SDS-PAGE 電泳液(干粉)、 ECL 發(fā) 光 液 購(gòu) 置 于 中 國(guó) wanleibio；LC3( WL01506 )、 BECLIN 1 ( WL02508 )、 P62(WL02385)、ATG5(WL02411)、羊抗兔IgG-HRP(WLA023)、內(nèi)參抗體β-actin(WL01372)購(gòu)置于中國(guó)wanleibio；辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素購(gòu)置于中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊血清、DAB 顯色液購(gòu)置于中國(guó)Solarbio。

電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海飛鴿儀器廠)；酶標(biāo)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)；水平搖床(北京六一)；電泳裝置(北京六一)；凝膠成像系統(tǒng)(北京六一)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司)；顯微鏡(日本OLUMPUS 公司)；16 道生理記錄儀(美國(guó)Biopac 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模及分組

腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)麻醉大鼠,BL-420F 生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或II 導(dǎo)聯(lián)心電圖[4],篩選并棄去ST 段有異常變化者和心律失常者。 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立,參考中醫(yī)證候心腎陽虛證以及吳向東[5]用大鼠建立的該種證候動(dòng)物模型并改進(jìn)。 取符合要求的健康SPF 級(jí)的雄性SD 大鼠70 只,隨機(jī)分為正常組(Control,10 只)、模型組(CHF,60 只)。 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg),麻醉后摘除雙側(cè)甲狀腺。 空白對(duì)照組行假手術(shù)。 術(shù)后第15 天起,模型組大鼠尾靜脈注射鹽酸阿霉素(4 mg/kg),空白對(duì)照組注射等劑量生理溶液,每周注射1 次,持續(xù)5 周。 術(shù)后第35 天將存活下來模型組動(dòng)物再次隨機(jī)分為5 組,即模型對(duì)照組(CHF)、芪藶強(qiáng)心膠囊組(QL,0.37 g/kg)、真武湯高劑量組(ZWG,1.35 g/kg)、真武湯中劑量組(ZWZ,0.81 g/kg)、真武湯低劑量組(ZWD,0.41 g/kg)各12 只。 次日灌胃相應(yīng)藥物,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃蒸餾水,連續(xù)10 d。

1.3.2 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠一般情況影響

給藥后每周測(cè)定大鼠體溫、體重,詳細(xì)記錄進(jìn)食數(shù)量和飲水情況。

1.3.3 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心臟指數(shù)的影響

稱取大鼠體重,處死后,迅速取出心臟組織,以生理鹽水清洗,稱取心臟重量,公式如下:CWI=大鼠心臟重量/大鼠體重×100%。

1.3.4 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響

第10 天給藥完畢30 min 后,打開已定標(biāo)好的十六道生理記錄儀及軟件后,以20%烏拉坦0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠,通過十六導(dǎo)系統(tǒng),觀察并記錄各組左室最大上升速率(+dp/dtmax)、左室最大下降速率(-dp/dtmax)等指標(biāo)的變化情況。

1.3.5 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠血清T3、T4和TSH 含量影響

大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,平均麻醉劑量為30 mg/kg,等待大鼠被麻醉后,用手術(shù)剪切開動(dòng)物的腹腔,迅速地剪斷股動(dòng)脈,進(jìn)行采血,最后分離血清,使用大鼠T3、T4、TSH 的ELISA 試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)測(cè)定大鼠血清中T3、T4、TSH 含量[6]。

1.3.6 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌細(xì)胞BNP、LA 和CaN 含量影響

取心肌組織,加入適量的蛋白萃取劑,心肌組織標(biāo)本勻漿化。 300 r/min,離心20 min。 收集上清。 同上述檢測(cè)方法類似,經(jīng)過稀釋、加樣、溫育、洗滌等步驟,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸分析計(jì)算濃度。

1.3.7 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、P62 蛋白表達(dá)影響

稱取心肌組織,通過全蛋白提取試劑盒(中國(guó)wanleibio) 進(jìn)行組織勻漿,低溫離心(4℃,12000 r/min,10 min)分離上清得到蛋白質(zhì)抽提物。 通過BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)wanleibio)測(cè)定蛋白含量。 加入20 μL 樣品并在10%及15%聚丙烯酰胺凝膠上分離。 轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h,用相應(yīng)的抗體探測(cè)。 使用對(duì)應(yīng)的免疫球蛋白試劑通過凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B 型,北京六一)觀察印跡,用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer 軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3.8 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織LC3 和P62 表達(dá)影響

固定后的心肌組織依次進(jìn)行包埋、透蠟、切片、抗原包被等程序,封片后于顯微鏡40×10 觀察染色效果并拍照。

1.3.9 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織病理變化的影響

固定后的心肌組織進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片、染色等程序,封片后于顯微鏡40×10 下觀察染色效果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行多組間差別用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),組間兩兩比較用方差分析后的LSD 檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01 為統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠一般情況影響

2.1.1 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠自然情況影響

各給藥組和模型對(duì)照組比較狀態(tài)較好,活動(dòng)較自如,癥狀有了明顯改善,飲食、飲水基本恢復(fù)正常,皮毛相對(duì)柔順而略有光澤,顏色由黃變淡,體重下降不明顯,精神狀態(tài)良好,較為活潑好動(dòng),生命體征總體好于模型對(duì)照組,結(jié)果見表1。

2.1.2 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠體重、體溫的影響

CHF 大鼠在造模后,體重下降趨勢(shì)顯著,與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),雖然芪藶強(qiáng)心膠囊和真武湯高中劑量可以改善體重的降低,但并無明顯差別(P＞0.05)。 體溫也隨著靜脈注射阿霉素時(shí)間的增加有所下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),結(jié)果見表2。

2.1.3 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心臟指數(shù)的影響

與空白組相比,心腎陽虛型心力衰竭大鼠心臟心臟指數(shù)雖有所增加,但無明顯變化(P＞0.05),結(jié)果見表3。

2.2 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

血流動(dòng)力學(xué)方面,模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較±dp/dpmax 變化十分明顯(P＜0.01),+dp/dpmax下降至空白對(duì)照組值的35.5%,說明造模成功[7]。芪藶強(qiáng)心膠囊和真武湯各劑量都能夠顯著抑制±dp/dpmax 變化(P＜0.05),說明真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌的收縮和舒張功能均有明顯改善作用,結(jié)果如表4。

2.3 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠血清T3、T4、TSH 含量的影響

除空白組外,T4的含量均較低(P＜0.05),說明甲狀腺清除完整,各給藥組可提高血清中T4含量,證明各給藥組可以改善心腎陽虛型CHF 大鼠甲狀腺功能；造模后大鼠血清TSH 的含量高于空白組(P＜0.05)。 證明造模后甲狀腺功能降低,機(jī)體需要通過增加TSH 來刺激T4產(chǎn)生。 結(jié)果見表5。

2.4 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌BNP、LA、CaN 含量的影響

與正常組比較,心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織LA 水平有所降低(P＜0.05),CaN、LA 含量有所升高(P＜0.05),而各給藥組均可對(duì)三個(gè)指標(biāo)具有不同程度調(diào)節(jié)作用,其中高劑量組作用最強(qiáng)(P＜0.05 或P＜0.01),結(jié)果見表6。

表1 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠自然情況影響(n=10)Table 1 Physiological state of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠體重、體溫的影響(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠體重、體溫的影響(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05Note.Compare with model group, *P＜0.05.

組別Groups體重(g)Weight體溫(℃)Body temperature正常組Control 304.43±17.78* 38.47±0.17模型對(duì)照組CHF 248.40±32.80 37.42±0.50芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 275.24±57.30* 37.08±0.62真武湯高劑量組ZWG 248.67±32.01* 37.00±0.33真武湯中劑量組ZWZ 251.62±56.30* 36.97±0.66真武湯低劑量組ZWD 209.61±19.33* 37.45±1.18

表3 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠心臟指數(shù)的影響(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表3 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠心臟指數(shù)的影響(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05。Note.Compare with model group, *P＜0.05.

組別Groups劑量Dose心臟指數(shù)(g/kg)CWI正常組Control —— 2.6726±0.2064模型對(duì)照組CHF —— 2.8408±0.7152芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 g/kg 2.8143±0.3638真武湯高劑量組ZWG 1.35 g/kg 2.9043±0.1667真武湯中劑量組ZWZ 0.81 g/kg 3.3972±0.1171*真武湯低劑量組ZWD 0.41 g/kg 3.0415±0.3002

表4 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表4 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)影響(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose左室最大上升速率(mmHg/s)+dp/dtmax左室最大下降速率(mmHg/s)-dp/dtmax正常組Control —— 5234.86±187.02** -5219.60±194.21**模型對(duì)照組CHF —— 1859.85±163.13 -1764.93±182.27芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 3786.41±181.17** -3577.87±128.38**真武湯高劑量組ZWG 1.35 2943.28±153.96** -2839.27±173.52**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 2441.53±149.23* -2521.64±160.86*真武湯低劑量組ZWD 0.41 2236.41±110.46 -2377.87±128.38

2.5 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白的影響

Western blot 結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,心腎陽虛模型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、BECLIN1 水平明顯降低,而各給藥組均能提高大鼠心肌組織中LC3、ATG5、BECLIN1 蛋白表達(dá)量。 與對(duì)照組比較,心腎陽虛模型CHF 大鼠心肌P62 水平變化不大,但各給藥組均能降低P62 蛋白表達(dá)量,其中真武湯各組降低作用明顯,結(jié)果見圖1,由左至右依次為正常組,模型對(duì)照組,芪藶強(qiáng)心膠囊組,真武湯高、中、低劑量組,詳見表7。

表5 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影響(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表5 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影響(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05。Note.Compared with the model group, *P＜0.05.

組別Groups劑量(g/kg)Dose三碘甲腺原氨酸T3(nmol/L)血清總甲狀腺素T4(nmol/L)促甲狀腺激素TSH(nmol/L)正常組Control — 0.04±0.01 0.75±0.09* 0.68±0.16*模型對(duì)照組CHF — 0.05±0.01 0.51±0.01 0.80±0.12芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 0.05±0.02 0.55±0.00* 0.82±0.09*真武湯高劑量組ZWG 1.35 0.05±0.01 0.57±0.02* 0.85±0.17真武湯中劑量組ZWZ 0.81 0.04±0.02 0.55±0.05* 0.83±0.19真武湯低劑量組ZWD 0.41 0.03±0.01 0.53±0.00* 0.83±0.19

表6 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影響(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表6 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影響(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別Groups劑量(g/kg)Dose乳酸LA(nmol/L)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶CaN(nmol/L)腦鈉肽BNP(nmol/L)正常對(duì)照組Control - 16.96±0.76* 1.35±0.30* 1.07±0.22*模型對(duì)照組CHF - 16.30±0.37 1.83±0.29 1.31±0.22芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 17.96±1.88* 1.45±0.30* 0.91±0.38*真武湯高劑量組ZWG 1.35 16.85±0.70* 1.33±0.29** 0.96±0.25**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 16.57±0.57 1.49±0.25* 1.02±0.25**真武湯低劑量組ZWD 0.41 16.33±0.67 1.55±0.21* 1.26±0.24

表7 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白相對(duì)蛋白含量的影響(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

表7 真武湯對(duì)心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白相對(duì)蛋白含量的影響(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

組別Groups 劑量(g/kg)Dose LC3 ATG5 Beclin1 P62正常對(duì)照組Control - 1.00±0.00*** 1.00±0.00*** 1.00±0.00* 1.00±0..00*模型對(duì)照組CHF - 0.66±0.11 0.71±0.23 0.95±0.07 1.13±0.18芪藶強(qiáng)心膠囊組QL 0.30 1.80±0.13*** 1.69±0.23*** 1.70±0.21*** 0.97±0.13*真武湯高劑量組ZWG 1.35 2.77±0.15*** 1.73±0.24*** 1.73±0.18*** 0.81±0.24**真武湯中劑量組ZWZ 0.81 2.83±0.13*** 2.01±0.23*** 1.20±0.22** 0.68±0.16***真武湯低劑量組ZWD 0.41 2.52±0.12*** 2.02±0.28*** 1.73±0.14*** 0.81±0.17***

圖1 心肌組織LC3(a)、ATG5(b)、BECLIN1(c)、P62(d)表達(dá)結(jié)果Figure 1 Results of LC3 (a), ATG5 (b), BECLIN1 (c), P62 (d) in myocardial tissue

2.6 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織LC3 和p62 表達(dá)影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組心肌BECLIN1、P62 表達(dá)量降低,各給藥組可以升高心腎陽虛型CHF 導(dǎo)致的P62 表達(dá)量的降低,見圖2。

2.7 真武湯對(duì)心腎陽虛型CHF 大鼠心肌組織影響

HE 染色結(jié)果可見:空白對(duì)照組心肌纖維間連接密集、纖維間分布平整,細(xì)胞與細(xì)胞之間距離正常；模型對(duì)照組心肌細(xì)胞邊緣不整,大面積心肌纖維溶斷,細(xì)胞間距加寬,心肌纖維排列混亂,存在局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,心肌組織產(chǎn)生局部水腫；各給藥組可使模型對(duì)照組的心肌細(xì)胞得到好的治療改善,結(jié)果見圖3。

3 討論

慢性心力衰竭中醫(yī)證型分類方式繁多各有側(cè)重,目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 相對(duì)比較權(quán)威的《中醫(yī)新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]辯證標(biāo)準(zhǔn)將本病分為7 個(gè)證型。 疾病的初期病理變化是心肺氣虛。 病情進(jìn)一步進(jìn)展則是氣陰兩虧、氣虛血疲。 而慢性心力衰竭較嚴(yán)重的階段則是心腎陽虛、陽虛水泛、痰飲阻肺。 在實(shí)驗(yàn)的過程中,我們通過手術(shù)將實(shí)驗(yàn)用大鼠兩側(cè)甲狀腺切除,再對(duì)它進(jìn)行尾部靜脈注射阿霉素之后,實(shí)驗(yàn)大鼠主要表現(xiàn)出毛皮灰黃、呼吸微弱、精神萎靡、畏寒蜷縮、大便溏瀉的癥狀,這些生命體征與人類中醫(yī)證候心腎陽虛證型非常相像[9]。 基源于此,我們認(rèn)為這組大鼠的表現(xiàn)與模擬的心腎陽虛證候十分吻合,根據(jù)上述研究?jī)?nèi)容,我們?cè)诮⑿哪I陽虛證的動(dòng)物模型時(shí),可以參考上述方案。

圖2 免疫組化檢查結(jié)果Note.A, Control.B, Model.C, QL.D, ZWG.E, ZWZ.F, ZWD.Compared with the model group, ***P＜0.001.Figure 2 Results of IHC

圖3 光鏡檢查結(jié)果Figure 3 Results by light microscopy

經(jīng)過大量的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),阿霉素在長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)可出現(xiàn)難以恢復(fù)的心臟毒性作用,而且由于阿霉素與心肌組織親和力顯著強(qiáng)于其他組織,因此可出現(xiàn)劑量不可逆的依賴性心肌損傷[10],可能與其機(jī)制相關(guān)的因素有:基因突變[10-11]；核酸、脂質(zhì)過氧化[12]；Ca2+超載[13]；能量代謝障礙[14-15]；自由基損傷[16]；產(chǎn)物的直接性損害[17]等。 目前,腹腔間斷性注射阿霉素已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于慢性心力衰大鼠模型的建立[18-19],并被認(rèn)為能夠高度模仿人體慢性心力衰竭的神經(jīng)-內(nèi)分泌機(jī)制和血流動(dòng)力學(xué)的改變,與其它造模方法相比,該法具有方法簡(jiǎn)單和復(fù)制性高的優(yōu)點(diǎn)。 因此本研究認(rèn)為尾靜脈注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益氣溫陽抗心衰的治療性研究。

本研究結(jié)果顯示,真武湯可以降低心腎陽虛型心力衰竭大鼠心肌組BNP 含量,說明其對(duì)心衰癥狀具有改善功能。 LA 作為運(yùn)動(dòng)時(shí)物質(zhì)代謝的產(chǎn)物,模型動(dòng)物L(fēng)A 含量降低說明心肌細(xì)胞功能下降,而真武湯能夠升高心肌組織LA 含量,降低CaN 含量,說明真武湯能夠改善心臟能量代謝。 心腎陽虛型CHF 大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG5、BECLIN1含量降低,P62 含量升高,說明心力衰竭初期心肌細(xì)胞有大量細(xì)胞發(fā)生自噬,真武湯可以升高心力衰竭大鼠自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、ATG5、BECLIN1 含量,降低P62 含量,說明真武湯在心力衰竭初期可以通過調(diào)節(jié)自噬保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞。

綜上所述,在進(jìn)行有關(guān)針對(duì)心腎陽虛型CHF 模型的構(gòu)建的研究時(shí),可以應(yīng)用阿霉素尾靜脈注射的方法,本研究認(rèn)為尾靜脈注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益氣溫陽抗心衰的治療性研究,并且,在臨床中針對(duì)本有不同程度符合心腎陽虛證型的慢性心力衰竭的患者,可以加以應(yīng)用真武湯進(jìn)行辨證論治。