基于數據挖掘的黃褐斑動物模型應用分析

武晏屹田 碩苗明三

(河南中醫藥大學,鄭州 450000)

黃褐斑又稱“妊娠斑”、“肝斑”、“黧黑斑”、“蝴蝶斑”等[1],由于皮膚黑色素的增加,形成褐色或黑色斑點,是一種色素沉著性、損容性皮膚病,多發于面部,尤以眼眶、兩頰、額部、口角等處最為常見[2]。其發病機制復雜,雖無明顯不適,但對患者的容貌、生活質量等有較大的影響[3]。 在多因素影響下,黃褐斑的發病率呈逐年上升趨勢[4],雖治療方法多樣,仍欠缺有效手段,是臨床上典型的易診難治性疾病。 黃褐斑理論研究、新藥篩選、中醫療法研究,與黃褐斑動物實驗的開展息息相關,故成功復制動物模型、選擇適宜的給藥方式及時間、合理檢測相關指標是順利進行動物實驗的必備條件。 同時文獻計量既能體現學科定量化的趨勢,又有助于科研人員了解相關領域的研究現狀[5],故本文以數據挖掘為主要手段,以“黃褐斑”為主題,檢索中國知網、萬方數據庫、維普數據庫中關于黃褐斑的實驗研究文獻,對已開展的黃褐斑模型應用現狀進行綜述、分析,為黃褐斑實驗研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 文獻篩選

1.1.1 檢索標準

以“黃褐斑”為主題,檢索中國知網、萬方數據庫、維普數據庫中關于黃褐斑的實驗研究文獻,時間范圍分別為“1960-2019、1990-2019、1979-2019”。 文獻來源為“全部期刊”。

1.1.2 納入標準

為動物實驗研究文獻。

1.1.3 排除標準

排除臨床研究文獻、細胞實驗、動物用藥、臨床用藥舉偶或臨床驗方、研究進展等文獻；重復的動物實驗研究報導只納入一次。

1.2 方法

詳細閱讀文獻,對文獻中涉及的實驗動物品種、模型復制方法、造模時間、給藥方式及時間、指標檢測等逐一輸入Excel 2013 建立數據庫,進一步對數據庫進行分析并繪制相關圖形進行展示。

2 結果

2.1 實驗動物應用概況

在中國知網數據庫、萬方數據庫、維普數據庫進行檢索,以主題為“黃褐斑”,時間范圍分別為“1960-2019、1990-2019、1979-2019”,文獻來源為“全部期刊”共篩選出104 篇黃褐斑動物實驗研究文獻,在復制動物模型時,以大鼠、小鼠、豚鼠最為常見,以小鼠應用居多,占52.88%；其次為豚鼠,占比35.58%。 其中尤以 KM 小鼠應用最多,占比44.23%,詳情見表1。 此外,在動物性別的選擇上也有顯著差異,其中82.69%文獻選用雌性動物,僅有13.46%的文獻選用雄性動物。

表1 黃褐斑模型實驗動物品種分布表Table 1 Experimental animal models of chloasma

2.2 模型復制方法概況

2.2.1 造模方法

目前常用的黃褐斑的造模方法大致可分6 種:黃體酮全身攻擊、紫外線照射、黃體酮全身攻擊聯合紫外線照射、紫外線照射聯合雌二醇局部涂抹、紫外線照射聯合束縛,以及可在聯合造模的基礎上增加動物慢性束縛來制備肝郁氣滯型黃褐斑模型。通過分析納入的104 篇實驗研究文獻,以紫外線照射最為常用(43.27%),其次為采用黃體酮全身攻擊聯合紫外線照射的方法復制模型(28.85%),詳情見表2。

再次，對城建稅、教育費附加、地方教育費附加、水利建設基金進行分析。商業銀行應當以增值稅額為計稅基礎，申報繳納附加稅費。

在使用紫外線復制模型時,紫外線波長全部在275～320 nm 之間,屬于中波紫外線,以320 nm 應用最多,占58.02%。 紫外線的照射時長與模型是否成功密切相關,其照射時間多在20～60 min 之間,最短為每天照射30 s,最長為60 min。 其中以照射60 min 最為常見,占37.04%,詳情見圖1。

在黃體酮全身攻擊時,所選用動物品種的不同,其肌肉注射的量也有區別,大鼠(3 篇)黃體酮注射量常用劑量為25 mg/kg,小鼠(29 篇)常用劑量為20 mg/kg；豚鼠(4 篇)常用劑量為20 mg/kg,最大劑量達到100 mg/kg。

2.2.2 造模時間

黃褐斑是一種慢性、獲得性色素增加性皮膚病,故無論采用何種造模方法,造模時間相對較長,以30 d 最為常見(48.08%),最長可達60 d,最短不少于7 d 成模,詳情見表3。

2.3 給藥及時間

臨床上主要采用中藥內服及外用、針灸等方法治療黃褐斑,分析納入的實驗研究文獻可知,其給藥方法主要涉及灌胃、局部外用、局部激光照射或配合激光導入藥物、皮下注射及針灸等。 其給藥方式也可分為造模后給藥、造模前給藥、邊造模邊給藥, 其中造模后給藥應用相對較多(54.81%),詳情見表4。 在驗證療效的過程中,常以臨床上公認的藥物為陽性對照藥,其中內服給藥 多 選 用 維 生 素 C (25.96%)、 百 消 丹 等(3.85%)；外用給藥則以氫醌乳膏(18.27%)應用最多,此外也有文獻采用氨甲環酸注射液、壬二酸等。 無論外用還是內服,其給藥時間大多分布在28 ～31 d(58.65%),最長給藥56 d,最短為脈沖照射等,僅給藥1 次,詳情見表5。

表2 黃褐斑造模方法統計表Table 2 Statistical analysis of chloasma modeling methods

2.4 實驗相關檢測指標概況

對于黃褐斑指標的檢測,可分為表觀指標、生化指標、病理指標,此外也有文獻對動物血液流變學特點的變化進行檢測。 不同的指標從表觀、微觀及分子生物角度分析藥物的作用效果及相關作用機制。 所分析的文獻中,有75.96%對動物皮膚、血清或肝中的相關生化指標進行分析；75.00%的文獻對病變局部皮膚狀況進行微觀定性或定量分析；僅有33.65%的文獻對皮膚局部的表觀狀態進行積分統計分析。 詳情見圖2。

圖1 紫外線照射時間分布圖Figure 1 UV exposure time

表3 黃褐斑模型造模時間統計表Table 3 Statistical analysis of the duration of chloasma model experimental periods

2.4.1 表觀指標

表觀指標可直觀、清晰的反映藥物對黃褐斑的療效, 在療效的判斷中占有重要地位[6]。 有33.65%的文獻對動物局部皮膚進行觀察并統計,主要觀察皮膚是否出現紅斑、增厚、脫屑、干燥、點狀斑塊、皮膚變硬、結痂、曬傷等情況,并對色斑面積、色斑顏色進行積分統計。

病理是診斷的金標準,可從微觀角度反映具體條件下疾病的本質,揭示組織異質性,反映組織病理生理學的微觀變化,可進一步揭露局部變化[7-8]。有75.00%的文獻通過HE 染色、Masson-Fontana 染色及免疫組化等方法對局部皮膚情況進行定性、定量分析。 對局部皮膚中黑色素細胞數目、脂褐質的含量、黑色素顆粒的面積、基底細胞層黑色素的沉著情況等進行定量分析；對表皮層中角化層是否增厚、膠原纖維是否變性、是否有炎癥細胞浸潤、毛細血管是否增多等情況進行定性分析。

2.4.3 生化指標

生化指標則能夠從分子水平反映病癥變化,是組織、器官機能狀態變化的一個重要指標,同時能夠進一步揭露藥物作用機制。 已有的實驗研究文獻對生化指標的檢測共可分為3 個方面:血清、皮膚勻漿、肝勻漿。

皮膚為黃褐斑病灶局部,其指標變化可揭示證型和微觀量化之間的某種聯系,可更加準確的反應局部病灶的病變情況及愈合情況,為探討藥物局部作用機制提供基礎。 已有的實驗研究文獻中,有75.96%的文獻測量皮膚勻漿中相關生化因子,共涉及20 種生化因子,其中以測量皮膚勻漿中的超氧化物歧化酶、丙二醛最為常見。

表4 給藥方式分布表Table 4 Types of drugs administered

表5 給藥時長分布表Table 5 Duration of drug administration

中醫認為黃褐斑病在皮,其病在內,與機體整體功能狀態密切相關,從其發病機制來看,多與機體內分泌失調、氧化與抗氧化失衡等有關,故在判斷療效及探討機制時,也常以血清中相關指標的變化來反應整體療效與機制。 已有的實驗研究文獻中,有30.61%的文獻測量血清中相關指標,包括氧化功能相關指標超氧化物歧化酶、丙二醛等,內分泌相關指標雌二醇、睪酮、孕酮等。

黃褐斑在中醫學上又稱“肝斑”,其疏泄功能異常是導致黃褐斑發病的主要原因。 此外,肝作為性激素結合球蛋白的主要合成場所,參與性腺激素的合成、轉化和滅活；肝也是生物體內重要的氧化還原反應場所[9],而氧化還原失衡及內分泌是黃褐斑主要的發病因素,故肝功能的調節在黃褐斑的發生、發展、加重上起著至關重要的作用。 已有的實驗研究文獻中,有34.69%的文獻涉及肝勻漿中相關生化因子的測量,主要包括超氧化物歧化酶、丙二醛、酪氨酸酶等。 詳情見表6。

3 討論

黃褐斑是一種色素代謝障礙性皮膚病[10],與內分泌失調、紫外線照射、皮膚屏障功能障礙、氧化與抗氧化失衡等密切相關[11-14],目前治療黃褐斑的方法包括口服預防紫外線輻射、局部增白劑、化學換膚、光療法和激光療法等[15]。 從中醫角度來講,黃褐斑以血脈不通為標,面部及體表色素沉著為主癥,與肝、脾、腎三大臟器息息相關,此外黃褐斑與血瘀密切相關,素有“有斑必有瘀,無瘀不成斑”之說[16]。 故中醫常以瘀、肝、脾、腎、肺論治[17-20],采用穴位注射、中藥面膜、或聯合舒肝顆粒進行治療[21-22],也有學者根據月經周期不同時期陰陽、氣血的變化規律,采用周期序貫的療法[23]。 此外也有采用中西醫結合如口服紅花逍遙片聯合外用氫醌乳膏等方法[24]。 雖臨床上治療黃褐斑的方法多樣,但其效果不盡人意,仍是典型的易診難治性疾病,且療程綿長,易反復[25]。 故尋找安全、高效的治療方法仍是各醫家不斷努力的方向,而動物實驗是探討黃褐斑理論知識、探究新療法、研制新藥物的基礎,打好動物實驗基礎,可提高治療黃褐斑的科學性、嚴謹性、安全性。

圖2 黃褐斑相關指標檢測概況Figure 2 Overview of the detection of chloasma-related indicators

表6 黃褐斑動物模型檢測指標分布表Table 6 Index of animal models of chloasma

黃褐斑動物模型的建立至今無國內外公認的標準[26],本文通過分析中國知網、萬方數據庫、維普數據庫中黃褐斑相關文獻發現,黃褐斑實驗研究性文獻僅有104 篇文獻,與黃褐斑的高發病率、高波及率、易診難治性、易復發性有較大出入。 在模型復制方面,目前尚未發現與黃褐斑發病過程完全相同的動物自發性黃褐斑模型,在實驗研究中多采用鼠類動物進行復制,目前選用的實驗動物主要有KM小鼠、豚鼠等。 鼠類動物與人類皮膚結構相近,且廉價易得,是復制黃褐斑模型的理想動物。 小鼠以其皮膚角化程度較低、皮膚及角質層厚度較小[27],更易受到紫外線照射的影響,且廉價易得,容易飼養[28-29],是研究者的首選動物。 此外,豚鼠皮膚結構與厚度與人的皮膚極為相似[30],其皮膚黑色素細胞和黑色素體的分布形態與人類更為相似[31],但其飼養成本相對較高、對飼養環境要求嚴格,指標檢測相關的抗體相對不足[32-33],因此其應用頻率僅次于KM 小鼠。 結合黃褐斑在臨床上具有顯著的性別差異[34],女性雌、孕激素變化水平明顯較男性活躍,故而發病率較高,因此在實驗研究中多選用雌性實驗動物,以更加貼近臨床實際。

復制黃褐斑動物模型主要是通過增加機體黑色素的產生及沉著,導致黃褐斑的形成。 經統計發現目前已有的實驗研究中,以單純的紫外線照射復制黃褐斑模型最為普遍,其操作簡便,模型成功率較高,基本符合黃褐斑臨床癥狀,但結合黃褐斑發病機制及影響因素,單純紫外線照射與發病過程存在較大差異,因此該方法更加適合藥效評價性實驗。 黃體酮注射液+紫外線照射法結合內分泌因素與紫外因素,更加貼近黃褐斑多因素致病發病過程,是黃褐斑發病機制及藥物作用機制研究的較理想模型。 在紫外線波長的選擇中,多采用中波紫外線(275～320 nm),能夠增加黑色素細胞的受體活性,其中以320 nm 最為常見；不同動物照射時間略有差異,小鼠皮膚角質層相對較薄,照射時間可適當縮短,豚鼠、大鼠則可適當延長,但一般集中在30-60 min 左右；不同動物黃體酮注射量也有一定差異,大鼠常注射25 mg/kg,小鼠及豚鼠的注射量則集中在20 mg/kg。 造模時間以30 d 最為常見,最短不少于7 d。 其給藥方式以造模后給藥應用相對較多,該給藥方式更加符合臨床實際。 此外,黃褐斑屬于慢性皮膚病,病程相對較長,給藥時間大多分布在28～31 d。 在陽性對照藥的選擇上,內服給藥以維生素C 較為常見,外用則以局部涂抹氫醌乳膏為多。 在指標的測量中,僅有33.65%的文獻涉及表觀指標的分析,表觀指標是對藥效的直觀反映,應在藥效評價中占有重要地位；75.96%的文獻以生化指標為主,側重于皮膚、血清、肝勻漿中的超氧化物歧化酶、丙二醛等氧化相關指標含量的變化,現代研究分析,黃褐斑的發病與內分泌的失衡密切相關,但僅6 篇文獻涉及激素相關指標,并以探討血清中含量的變化為主；71.43%的文獻涉及局部皮膚病理變化的檢測,通過定量與定性觀察,從微觀角度評價藥物療效及潛在作用機制。

綜上分析,對黃褐斑的實驗研究及理論探討與黃褐斑發病現狀嚴重失衡,未來應增加動物實驗研究,以進一步明確黃褐斑的發病機理、藥物療效及作用機制,為臨床研究提供確鑿的理論依據。 在模型復制方面,已有的模型制備方法缺乏中醫致病因素的干預,缺少不同證型的黃褐斑動物模型建立方法,因此建立復合動物模型、具有中醫病癥特點的動物模型是未來重要的研究方向。 目前對藥物作用機制的研究僅局限于體內、體表氧化與抗氧化失衡,忽略內分泌失調等相關因素。 此外,大量理論探討及實驗研究發現,黃褐斑與體內NEI 網絡的紊亂密切相關[35],隨著體表NEI 網絡的提出與深入研究,皮膚作為人體最大的器官,同樣存在著分泌、代謝黃褐斑相關生化因子,具備相應的受體,如α-黑色素細胞刺激素、白介素-1,白介素-6、一氧化氮、孕酮、雌二醇等[36],故在黃褐斑的治療中,是否通過調節體內、體表NEI 網絡而發揮整體、局部療效可能是未來重要研究方向,值得進一步深入探討。