轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在豬上的研究進(jìn)展

黃全奎，周松峰，邢 凱，白云華

（1.廣西里建桂寧種豬有限公司，廣西 南寧530105；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；3.北京百凈保科技發(fā)展有限公司，北京100193）

轉(zhuǎn)錄組廣義上是指在某一生理或試驗(yàn)條件下，由單個(gè)細(xì)胞、組織或個(gè)體等所產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA；狹義上是指所有mRNA的集合。在一般情況下，如果不特別強(qiáng)調(diào)，轉(zhuǎn)錄組就是指mRNA。轉(zhuǎn)錄組代表了樣本（細(xì)胞、組織等）整體的基因表達(dá)水平，因此也被稱為“表達(dá)譜”，通常采用基因表達(dá)譜芯片和RNA-seq技術(shù)來研究。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序所需的時(shí)間和成本大大降低，其在畜牧行業(yè)得到了大量應(yīng)用及研究，在豬上也不例外。科研工作者根據(jù)自己的研究目的，針對(duì)不同表型、不同處理?xiàng)l件、不同時(shí)期及不同組織間的差異，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)而篩選差異表達(dá)基因，進(jìn)行功能基因組的研究。

1 不同表型

針對(duì)極端表型個(gè)體的關(guān)鍵器官或組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，是挖掘影響此表型關(guān)鍵基因的重要方法之一。脂肪沉積在養(yǎng)豬生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，研究者針對(duì)不同脂肪沉積能力的豬做了研究。Chen等針對(duì)具有極端生長(zhǎng)表型的豬的腹脂、肝臟和背最長(zhǎng)肌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別發(fā)現(xiàn)2 796、1 551和835個(gè)差異表達(dá)基因，并認(rèn)為胰島素樣生長(zhǎng)因子2（IGF2）、細(xì)胞色素P450家族成員1A1（CYP1A1）、肌肌酸激酶（CKM）和羧酸酯酶1（CES1）等基因在脂肪發(fā)育過程中發(fā)揮了重大的作用[1]。Xing等檢測(cè)了具有極端背膘厚度的松遼黑豬的脂肪組織和肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組，分別檢測(cè)出188和92個(gè)差異表達(dá)基因，通過功能分析發(fā)現(xiàn)脂肪組織是影響脂肪沉積的主要器官，脂肪酸的從頭合成通路是影響脂肪沉積的主要原因，并在長(zhǎng)白豬上有了相同的發(fā)現(xiàn)[2]。Zambonell等檢測(cè)了具有極端背膘厚度的意大利長(zhǎng)白豬的背膘組織，發(fā)現(xiàn)了86個(gè)差異表達(dá)基因，主要參與了炎癥反應(yīng)等過程[3]。Lim等比較了極端高低組（n=3）肌內(nèi)脂肪含量的巴克夏豬的背最長(zhǎng)肌肌肉組織，檢測(cè)到134個(gè)差異表達(dá)基因，主要參與了脂肪酸的從頭合成和肌肉再生等過程[4]。公豬膻味是一個(gè)影響肉質(zhì)的不良性狀，主要是由于雄烯酮和糞臭素在脂肪中的積累而導(dǎo)致的。Gunawan等檢測(cè)了具有極端差異背膘雄烯酮含量的豬肝臟和睪丸的轉(zhuǎn)錄組，分別發(fā)現(xiàn)了448和46個(gè)差異表達(dá)基因，其中免疫應(yīng)答基因6（IRG6）、抗病基因1（MX1）、干擾素誘導(dǎo)基因2（IFIT2）、細(xì)胞色素P450家族成員7A1（CYP7A1）、含黃素單氧化酶5（FMO5）和角蛋白18（KRT18）可能是影響公豬膻味的候選基因[5]。生長(zhǎng)速度和剩余采食量是豬重要的經(jīng)濟(jì)性狀，并且互相影響。Jing等比較了具有極端剩余采食量的長(zhǎng)白公豬（10頭），檢測(cè)出99個(gè)差異表達(dá)基因，其中脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3）、鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白（RCAN）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1A（PGC-1A）、己糖激酶2（HK2）、AMP激活的蛋白激酶r-2調(diào)節(jié)亞單位（PRKAG2）等基因參與了能量代謝和脂肪酸的跨膜運(yùn)輸[6]。Liu等比較了35日齡左右的高低組剩余采食量的仔豬（n=15），鑒定出1 972個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因參與了小分子生物物質(zhì)的合成等生物學(xué)過程[7]。

豬肉品質(zhì)是影響消費(fèi)者選擇豬肉的重要因素。Li等比較了不同滴水損失的背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組，鑒定出150個(gè)差異表達(dá)基因，其中三合蛋白（TRDN）和肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）可能是滴水損失的主要候選基因[8]。Gi等檢測(cè)了不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的胎盤組織，發(fā)現(xiàn)了588個(gè)差異表達(dá)基因，其中白介素-6（IL-6）和內(nèi)皮脂肪酶（LIPG）在胚胎發(fā)育營(yíng)養(yǎng)供給上發(fā)揮著重要的作用[9]。Zhang等比較了不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的卵巢轉(zhuǎn)錄組，檢測(cè)出1 243個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因參與了類固醇生物合成和卵巢類固醇生成[10]。Zhao等比較了具有極端飼料轉(zhuǎn)化率的豬的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)232個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分關(guān)鍵基因參與了維生素A代謝、脂肪酸代謝和膽固醇類激素代謝等通路，并認(rèn)為維生素A在豬肝臟中的代謝，對(duì)于調(diào)控豬飼料效率具有重要作用[11]。

2 不同品種

在豬長(zhǎng)時(shí)間的選擇和進(jìn)化過程中，不同品種在生理特點(diǎn)上產(chǎn)生了很大的差異。通過比較不同品種間的轉(zhuǎn)錄組，得到差異表達(dá)基因，為揭示豬生理特點(diǎn)的分子功能解析提供了基礎(chǔ)。不同豬品種間肌肉的發(fā)育形態(tài)、肉質(zhì)品質(zhì)、肌內(nèi)脂肪含量等方面有較大的差異，科研工作者針對(duì)不同豬種間的差異做了較多的研究。Li等比較了皖南花豬和大白豬的背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組，篩選到的差異表達(dá)基因部分參與了糖類分解和脂肪酸的代謝的過程[12]。Sun等比較了長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬的背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組，篩選到547差異表達(dá)基因，主要富集在肌肉生成等過程中[13]。Yang等對(duì)沙子嶺豬和大白豬的背最長(zhǎng)肌組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到488個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分參與了脂肪酸代謝、肌肉發(fā)育等過程[14]。Chen等比較了萊蕪豬和大白豬背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了178個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因參與脂肪代謝，可能影響了肌內(nèi)脂肪含量的沉積[15]。Hou等比較了瘦肉型豬 長(zhǎng)白豬、脂肪型豬 通城豬和小型豬 五指山豬的背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)基因參與了脂肪代謝、肌肉發(fā)育等過程[16]。張東杰等比較了民豬和大白豬的背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了1 098個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因富集在過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號(hào)通路等通路，為研究影響肉質(zhì)的遺傳因素提供了依據(jù)[17]。楊建敏等比較了槐豬和杜洛克豬的背最長(zhǎng)肌轉(zhuǎn)錄組，檢測(cè)到953個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因參與了調(diào)節(jié)脂類代謝的通路[18]。Ropkamoik等比較了皮特蘭豬和波蘭長(zhǎng)白豬的半膜肌肉組織，檢測(cè)到35個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因參與了肌肉收縮等過程[19]。Zhao等比較了通城豬和大白豬11個(gè)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出大量差異表達(dá)基因，為研究肌肉發(fā)育和肉質(zhì)提供了分子基礎(chǔ)[20]。Li等比較了二花臉豬和大白豬背最長(zhǎng)肌的轉(zhuǎn)錄組，篩選到808個(gè)差異表達(dá)基因，為解釋種間差異奠定了基礎(chǔ)[21]。Xing等比較了松遼黑豬和長(zhǎng)白豬背膘組織的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因參與了脂肪酸合成、胰島素抵抗和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等過程[22]。Codina等比較了大白豬和伊比利亞豬睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組，檢測(cè)到大量差異表達(dá)基因，并顯著地富集在配子生產(chǎn)和脂類代謝等通路上[23]。Hu等比較了大蒲蓮豬和長(zhǎng)白豬的全血液轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，檢測(cè)到83個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分富集在免疫應(yīng)答和脂質(zhì)代謝等通路上[24]。

3 不同處理?xiàng)l件

通過全面分析某一組織在不同處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的變化，能夠揭示特定生物學(xué)過程的分子調(diào)控機(jī)制。在這方面的研究中，通過飼喂不同營(yíng)養(yǎng)水平的日糧來研究轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平是重要組成部分。Og?uszka等比較了飼喂不同不飽和脂肪酸（ω-6和ω-3）長(zhǎng)白豬的臀肌和肝臟的轉(zhuǎn)錄組，分別篩選到749個(gè)和3 565個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因富集在調(diào)控脂肪酸代謝、能量代謝和免疫應(yīng)答等信號(hào)通路上，為脂肪酸在豬生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用打下基礎(chǔ)[25,26]。 wi?tkiewicz等比較了飼喂不同脂肪酸含量日糧的豬肝臟轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A4（APOA4）、長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶5（ACSL5）、細(xì)胞色素P 4 5 0家族成員2C49（CYP2C49）、細(xì)胞色素P450家族成員2B22（CYP2B22）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ω-1（GSTO1）等基因在不同處理組中顯著差異表達(dá)，揭示它們可能存在共調(diào)控作用[27]。Xia等比較了飼喂高脂高糖日糧的巴馬香豬和對(duì)照組的肝臟組織轉(zhuǎn)錄組，篩選到822個(gè)差異表達(dá)基因，其中部分基因參與了免疫應(yīng)答、MAPK和PPAR等信號(hào)通路，為研究高能量飲食對(duì)豬肥胖和脂肪肝的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)[28]。李建平等比較了不同脂肪來源（紅花籽油和椰子油）日糧及對(duì)照組之間的豬肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到多個(gè)差異表達(dá)基因，為其作為飼料的功能研究奠定了基礎(chǔ)[29]。Li等比較了二元（長(zhǎng)白h大白）豬和萊蕪豬感染豬圓環(huán)病毒2型35 d前后的腎臟組織的轉(zhuǎn)錄組，從萊蕪豬中篩選出169個(gè)差異表達(dá)基因，而在長(zhǎng)白豬中發(fā)現(xiàn)205個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要富集在補(bǔ)體系統(tǒng)、外源物質(zhì)代謝等通路上[30]。

4 不同時(shí)期

豬在不同的發(fā)育時(shí)期有著不同的生物學(xué)特點(diǎn)。通過比較不同時(shí)期豬某些特定組織的轉(zhuǎn)錄組來鑒定基因的功能是研究重要手段之一。Song等比較了長(zhǎng)白豬未成熟和成熟的睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選到10 095個(gè)差異表達(dá)基因，其中有242個(gè)差異表達(dá)基因參與了生精的過程，為了解豬的生精過程和性成熟的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)[31]。Lee等比較了5 d和180 d豬睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選到607個(gè)差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、谷胱甘肽過氧化酶1（GPX1）、趨化因子受體1（CCR1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）、白細(xì)胞分化抗原14（CD14）等基因可作為豬生精干細(xì)胞的生物標(biāo)記[32]。Jiang等比較了脂肪細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞在發(fā)育0 d、2 d和4 d時(shí)的轉(zhuǎn)錄組，分別在兩細(xì)胞中篩選到985個(gè)和1 469個(gè)差異表達(dá)基因，其中576個(gè)基因是在兩種細(xì)胞中共同差異表達(dá)的，并認(rèn)為PPAR信號(hào)通路在兩種脂肪細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要作用[33]。Li等比較了脂肪型榮昌豬不同時(shí)期的脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，篩選到差異表達(dá)基因4 403個(gè)，為研究脂肪組織的發(fā)育提供了基礎(chǔ)[34]。Shan等比較了巴馬香豬和藏豬不同發(fā)育時(shí)期腦下垂體的轉(zhuǎn)錄組，檢測(cè)到大量差異表達(dá)基因，其中生長(zhǎng)激素（GH）、催乳素（PRL）、黃體生成素β亞基（LHB）和促卵泡激素β亞基（FSHB）等基因可能在發(fā)育過程中起著重要的作用[35]。Lin等比較了母豬發(fā)情后12 d、18 d和25 d的子宮內(nèi)膜組織的轉(zhuǎn)錄組，分別發(fā)現(xiàn)1 557、8 951和2 345個(gè)差異表達(dá)基因，為研究豬的子宮內(nèi)膜功能打下基礎(chǔ)[36]。

5 不同組織

不同組織在生物體內(nèi)發(fā)揮著不同的作用，通過比較其轉(zhuǎn)錄組的差異，是挖掘基因功能的重要手段。Wang等比較了豬皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在免疫應(yīng)答等通路，揭示了不同脂肪組織在豬體內(nèi)發(fā)揮著不同功能[37]。Mach比較了不同的豬小腸組織（十二指腸、空腸）的轉(zhuǎn)錄組，篩選到大量的差異表達(dá)基因，主要富集在基本的生物學(xué)過程中，為揭示豬腸道的精細(xì)功能奠定基礎(chǔ)[38]。Li等比較了豬肱二頭肌和比目魚肌的轉(zhuǎn)錄組，鑒定到52個(gè)差異表達(dá)基因，主要富集在與肉色性狀相關(guān)的通路上，揭示了部分調(diào)控肉色的分子機(jī)制[39]。Gan等比較了榮昌豬的肝臟組織和腦組織的轉(zhuǎn)錄組，鑒定出大量差異表達(dá)基因，為更確切地了解豬肝臟和腦的分子功能打下基礎(chǔ)[40]。

6 展望

綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)廣泛地研究了豬的生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪代謝、肌肉生長(zhǎng)、繁殖生理、免疫應(yīng)答等各個(gè)生理過程，已經(jīng)成為鑒定mRNA表達(dá)豐度和鑒定新轉(zhuǎn)錄本的重要技術(shù)手段。同時(shí)結(jié)合如小的非編碼單鏈RNA（miRNA）組、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）組、全基因甲基化組、全蛋白組等組學(xué)信息，為鑒定基因的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。但是大部分的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究只是構(gòu)建了差異表達(dá)基因參與的通路，其分子調(diào)控和遺傳機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。這也是未來在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上的研究重點(diǎn)。