神經系統退行性疾病基因治療的研究進展

丁 婧 趙琳琳 曲 揚 高 騰 楊濱瑞 張驚宇

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科，哈爾濱 150001)

神經系統退行性疾病是一類原因尚不十分明確的慢性進行性損害神經等組織的疾病，表現為神經元進行性變性及壞死，引起認知、情緒及行為異常，代表疾病包括帕金森病(Parkinson′s disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)以及肌萎縮性側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。當前臨床對于神經退行性疾病的治療仍以對癥治療為主，尚缺少針對病因的可以逆轉疾病的有效治療方法。而基因治療則被認為是目前治療神經退行性疾病的有力工具[1]。如何使基因真正靶向作用于神經系統并且達到一定轉導效率仍是基因治療必須要解決的問題。同時，基因治療涉及的復雜實施步驟以及未來臨床試驗中面對的倫理問題都需要不斷探索與解決，從試驗研究到臨床應用仍需要漫長過程。盡管如此，基因治療仍以其早期精準診斷的極大優勢與良好的應用前景吸引著越來越多的研究者參與其中。目前常用的基因治療的病毒載體包括腺相關病毒載體(AAV)和慢病毒載體[2]。本文對神經系統幾個代表性退行性疾病的基因治療的研究進展進行綜述，以期為神經系統退行性疾病的基因治療提供理論依據。

1 帕金森病

PD是一種神經退行性疾病，其特征是黑質致密部多巴胺能神經元的喪失和紋狀體多巴胺水平的降低，其癥狀主要包括僵硬、靜息性震顫和運動功能損害(如運動遲緩)。20世紀后期發現，在希臘、德國和意大利的個別家族性PD患者中存在α-突觸核蛋白基因突變，截至目前，已經發現了至少有10個單基因與家族性帕金森病連鎖的基因位點。同時，基因易感性也可導致PD患病概率增加。目前的治療標準包括用左旋多巴和深部腦刺激(DBS)等替代多巴胺。左旋多巴能以不同的效率恢復某些運動功能，但隨著PD的進展，左旋多巴的療效亦不盡如人意，且其副作用變得更加明顯，而DBS雖可減輕PD的癥狀，但沒有針對其病因，此外，DBS亦可加劇患者認知和情緒惡化，這是晚期PD的特征[3]。基于此，基因治療PD的可能性則被廣泛探討。又有研究表明，在盲Ⅱ期臨床試驗中唯一顯示療效的試驗是通過直接注射到丘腦底核(NCT00643890)的方式釋放AAV2谷氨酸脫羧酶(GAD)，且與對照組相比，接受AAV2-GAD治療的患者癥狀有所改善[4]。有實驗表明，AAV2將NRTN(Cere-120)輸送到殼核以支持多巴胺能神經元(NCT0040634)，分析Ⅱ期試驗患者死后腦組織發現，雖然紋狀體/殼核注射區的NRTN表達增加，但黑質沒有相應的增加，這被認為是由于多巴胺能神經元的逆行運輸失敗所致[5]。而對于這種結果，后期亦有實驗研究表明，在實驗中同時注射殼核和黑質，并隨著殼核傳導的增加而增加劑量，結果顯示該策略顯著增加了NRTN的表達[6,7]。Quintino等[8]對嚙齒動物PD模型測試結果表明，甲氧芐啶可能穿過血腦屏障并與DD結構域結合，并可調節GDNF的表達，以此保護神經元并改善運動功能，然而值得注意的是，這些動物的基因治療是在PD誘導PD前進行的，有必要對已經出現PD癥狀的動物進行進一步研究，以確定其治療效果。

2 阿爾茨海默病

AD是一種進行性神經退行性疾病，其特征是記憶、思維和行為障礙，疾病進展與膽堿能神經元變性和淀粉樣蛋白β(Aβ)斑塊的形成有關。家族性AD最常見的基因突變包括21號染色體淀粉樣前體蛋白基因，14號染色體早老素1基因以及1號染色體早老素2基因，此三種基因突變均能夠導致Aβ的過度形成。散發性AD截至目前研究肯定與其有關的為載脂蛋白E基因。

2.1降低Aβ水平 家族性AD是由Aβ前體蛋白(APP)基因突變或蛋白酶將前體蛋白切割成片段引起的，在治療方面主要采用膽堿酯酶抑制劑，可在一定程度上緩解AD患者的癥狀[9,10]。有學者研究了AD斑塊形成、細胞凋亡以及使用生長因子等過程，結果顯示抑制斑塊形成的一個重要方式是降低大腦中Aβ和Tau的水平，而一種表達miRNA的AAV可降低AD的3轉基因小鼠模型中的Aβ水平，即膽固醇酰基轉移酶1(ACAT1)[11,12]。又有研究指出，將含有leptin基因(LEP)的慢病毒載體ICV注射到雙轉基因AD小鼠體內，導致Aβ負和tau磷酸化降低，突觸密度提高[13]。而在AD小鼠海馬齒狀回注射一種表達卷蛋白同源物F-spondin(SPON1)的慢病毒載體，可改善其記憶和學習，降低Aβ斑塊沉積水平，說明慢病毒載體可有效改善AD小鼠的記憶以及學習，對AD有較好的干預作用。

2.2降低Tau磷酸化 有研究表明，早期AD患者海馬中的瘦素減少，而含有瘦素基因(LEP)的慢病毒載體ICV注入雙轉基因AD小鼠體內，可降低Aβ負荷降低Tau磷酸化，提高突觸密度，說明瘦素基因亦可通過干預Aβ以及tau磷酸化而有效改善AD的發生[14]。復有研究發現，在AD發生的早期，其腦內則可見Tau的過度磷酸化，且可高于正常水平的3～4倍，并導致Tau蛋白從微管蛋白上脫落，進而引起神經細胞變異，且脫落的Tau蛋白又可因構象的改變而引起親和力的升高，并將單體變為可溶性寡聚體，并致使原纖維絲甚至是AD的病理標志物NFT的形成，說明只有降低Tau的過度磷酸化才可有效改善AD的發生與發展[15]。

2.3降低caspase-3水平 研究指出，在小鼠腦內注射鋁誘導凋亡后，對表達shRNA抗caspase-3(CASP3)的慢病毒載體進行了檢測，結果發現，慢病毒shRNA抗CASP3導致caspase-3水平降低，細胞死亡，學習以及記憶功能改善，這說明慢病毒shRNA抗CASP3可有效改善AD患者的學習及記憶的能力[16]。又有研究表明，在AD的動物模型中發現，皮層和海馬神經元的大量減少為主要的病理特征[17]，這可能與細胞凋亡有一定的關系，而細胞凋亡參與細胞分化、胚胎發育及細胞更新，其細胞凋亡機制發生障礙可導致多種疾病，且細胞凋亡因子caspase-3 和caspase-8基因的高表達可導致動物體腦內神經元的凋亡，且Aβ42 的二聚體和/或四聚體等低聚物能夠顯著升高谷氨酸水平，亦引起神經元的壞死，這說明對細胞凋亡因子caspase-3和caspase-8基因的干預可有效保護神經元，進而抑制AD的發生與發展。

3 肌萎縮性側索硬化

ALS，也稱為盧·格里格病，是一種進行性的、致命的神經退行性疾病，由于大腦、腦干和脊髓上下運動神經元喪失導致，通常在2～5年內死亡，ALS可表現為散發性的，亦可表現為家族性的，且與許多基因和疾病的發展有關[18]。此前研究表明，約20%的家族性ALS和2%的散發性ALS與銅(鋅)超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突變有關。近年發現，1號染色體TAR DNA結合蛋白基因突變與家族性ALS及散發性ALS均有關聯。9號染色體C90RF72基因非編碼區GGGGCC 6核苷酸重復序列與25%左右的家族性ALS相關。對于家族性ALS而言，通過靶向特定的突變來進行ALS的基因治療尤為重要，且改變受影響基因的表達也已被證明是有效的，而這種方法主要是對最先被鑒定為可引起ALS突變的SOD1基因進行了測試，方法為將反義寡核苷酸(ASOs)輸注到SOD1鞘內進行試驗(NCT0041222)，但單用ASOs的缺點是需要持續輸注或重復給藥，而使用病毒載體傳遞ASO或短發夾shRNA可以避免這個問題，且結果顯示AAV9-SOD1-shRNA可有效降低大鼠模型中SOD1基因的表達，說明AAV9-SOD1-shRNA為ALS基因治療的新方向。研究表明，鞘內注射表達單鏈抗體的AAV9以對抗錯誤折疊的SOD1的方法可有效延遲過度表達突變形式SOD1的轉基因小鼠的發病并延長壽命[19]，同時亦指出其有可能應用于其他已知的引起突變的ALS，說明鞘內注射表達單鏈抗體的AAV9對ALS具有一定的療效。有研究表明，miRNA 155在SOD1小鼠和人ALS脊髓標本中的表達增加，通過寡核苷酸阻遏物抑制miRNA 155在SOD1小鼠中的表達，可延長生存期和疾病持續時間，這說明抑制miRNA 155可有效抑制AD的進一步發展[20]。

4 結語

常見的神經系統疾病多表現為神經退行性的病變，而目前針對神經退行性疾病的治療仍是難題，臨床上以對癥綜合治療及護理為主，缺少有針對性的治療方案與手段。研究發現多種神經系統退行性疾病是由于基因突變引起，如果能夠從疾病基因發病機制上對其進行早期診斷和干預即采取基因治療手段，其優勢顯而易見。初步試驗表明，將基因治療藥物輸送到中樞神經系統是安全和耐受的，而為了改善傳遞效率，新的載體也已經被識別和開發。AAV9就是其中之一，其可以穿過血腦屏障，具有很強的神經元傾向性。而病毒載體的另一個值得注意的進展是ProSavin基因治療試驗中使用的多順反子慢病毒載體，也可成為基因治療中有效的載體。同時亦有另一個正在取得進展的基因治療領域是向中樞神經系統直接提供基因治療的方法，如ICV、鞘內注射和直接注射到大腦和脊髓中的遞送方法，且一直在不斷的研究發展和完善之中。

本綜述從神經系統退行性疾病PD、AD以及ALS 3種具有代表性的疾病著手進行總結與論述，以求更好地了解神經退行性疾病的病因，進而可以對其做出早期診斷，為靶細胞丟失之前進行干預提供可能，鑒于上述疾病的試驗結果推測，在出現明顯癥狀、靶細胞丟失之前對疾病進行治療，可能會影響治療效果。這些進展的結合將有助于將新的基因療法應用于臨床，從而在治療此類神經系統退行性疾病方面取得真正的進步。