啤酒釀造過程中酵母胞內有機鋅與風味代謝物質的相關性

宋玉梅，謝鑫，趙楠，郭立蕓

(北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京，101300)

酵母作為啤酒釀造的四大原料之一，其發酵過程可賦予啤酒獨特的風味和口感，同時優良性能的酵母亦是保證啤酒質量穩定的重要前提[1-2]。鋅作為啤酒釀造中的無機微量金屬離子，對促進酵母細胞內生化反應的進行起著重要作用。研究發現，在酵母生長過程中，鋅離子主要分為酵母總鋅和酵母胞內有機鋅[3-4]，其中酵母總鋅指吸附于酵母細胞表面的無機鋅離子，必須與有機配位體螯合后才能進一步為機體所吸收利用，而經與蛋白螯合后的有機鋅由于更接近于機體內的作用形式被稱為酵母胞內有機鋅，其生物學價值和可用性也遠遠高于無機鋅[5-6]。

啤酒釀造過程中，酵母胞內有機鋅可有效地促進酵母菌體的生長繁殖、加速蛋白質和維生素的合成[7-9]。鋅離子作為α-淀粉酶和磷酸酶的激活劑，可提高α-淀粉酶和磷酸酶的活性，進而提高淀粉的分解速度，縮短糖化時間；有機磷酸鹽在磷酸酶的分解下產生磷酸，可進一步改善醪液的緩沖性，使各種酶系在適宜的pH范圍內發揮作用[10-11]。同時鋅離子作為啤酒中泡沫的促進劑，還能起到增強啤酒泡沫的強度，提高啤酒非生物穩定性的作用[12]。

啤酒風味物質是啤酒釀造過程中由于酵母代謝而產生的一系列揮發性和非揮發性物質的總稱，構成了啤酒特有的香味和口感[13]。目前國內外學者關于酵母代數、批次、品種及接種量對酵母發酵過程中風味物質的影響已有較多的研究[14-18]，而鋅離子作為促進揮發性酸、醛類以及雙乙酰等物質產生的重要金屬離子，其對風味代謝物質的影響還鮮有報道。本文從啤酒酵母菌株YJ02出發，探究不同傳代次數和外源添加鋅離子對酵母胞內有機鋅的影響，并進一步對酵母菌株YJ02代謝過程中揮發性物質進行檢測，以期闡明酵母胞內有機鋅與風味代謝物質的相關性，為酵母發酵過程中風味物質的控制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種及材料

啤酒酵母菌株YJ02，保藏于北京燕京啤酒股份有限公司技術中心酵母菌種保藏室。

13 °P麥汁，北京燕京啤酒股份有限公司糖化車間生產；酵母泥，北京燕京啤酒股份有限公司釀造車間發酵罐種酵母泥。

1.2 試劑與儀器

ZnSO4、pH 6.5 10mmol/L EDTA溶液、葡萄糖、丙酮等,國藥集團化學試劑有限公司。

NexlON電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)，Perkin-Elmer儀器有限公司；Alpha2-4真空冷凍干燥機，德國Martin Christ公司；7697A-7890B氣相色譜儀，Agilent Technologies公司；MVS-1漩渦混合儀，北京金水德工貿有限公司；FE 28 pH計，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；JB-3A恒溫定時攪拌器，上海雷磁創益儀器儀表有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同鋅離子含量麥汁的制備

取糖化車間煮沸前麥汁(未添加ZnSO4)，加熱煮沸1 h后加入20 g/L硅藻土(粗細比例為1∶1)進行過濾，并于115 ℃下滅菌20 min，待無菌麥汁冷卻后進一步使用無菌濾紙過濾以去除麥汁中冷凝固物，并檢測濾液中的鋅離子含量。同時將處理后的麥汁分裝至三角瓶中，按照不同梯度添加過濾除菌的ZnSO4溶液使麥汁中鋅離子含量分別為0.2、0.4、0.6、1.4、3.4 mg/L。

1.3.2 發酵方法

取不同濃度梯度下500 mL麥汁進行三角瓶發酵，每天進行搖瓶稱重追蹤CO2失重量，當CO2失重量小于0.2 g時進行相關指標的檢測。

1.3.3 相關指標測定

1.3.3.1 酵母活力

參考應用酵母活力值評價啤酒生產酵母的發酵性能[19]的方法在發酵結束后收集酵母泥進行檢測。

1.3.3.2 酵母總鋅

發酵結束后于4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，重復3次后收集酵母泥，使用純水和pH 6.5 10 mmol/L EDTA溶液各洗滌1次后，于8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，棄取上清液收集酵母細胞，120 ℃下烘干至恒重并使用ICP-MS進行檢測。

1.3.3.3 酵母胞內有機鋅

在發酵結束后收集酵母泥，分別使用純水和pH 6.5 10 mmol/L EDTA溶液洗滌后于4 ℃、6 000 r/min條件下離心1 min，棄去上清液后于沉淀中加入氧化鋯研磨珠和100 μL純水進行旋渦振蕩破碎；收集破碎酵母細胞提取液，并加入700 μL純水混勻，4 ℃離心10 min后收集上清液，并重復以上步驟共計5次；合并離心后的上清液并添加等體積的丙酮(-20 ℃預冷)，混合均勻后于-20 ℃放置2 h，4 ℃離心10 min，棄去上清液得到酵母胞內蛋白沉淀；將酵母胞內蛋白沉淀通風干燥10 min后加入2 mL超純水，真空冷凍干燥24 h以徹底去除水分和殘留的丙酮，收集凍干后的酵母胞內蛋白(胞內有機鋅以與蛋白螯合的形式存在)，消解后使用ICP-MS檢測。其中酵母破碎率計算公式如下：

(1)

1.4 數據處理

用Excel 2019對數據進行處理和作圖，用SAS V8對數據進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 研磨珠對酵母破碎率的影響

由于研磨珠的型號和材料對酵母破碎率有較大影響，本試驗分別選用不銹鋼和氧化鋯2種材料的研磨珠，探究0.5和1.0 mm研磨珠對酵母菌株YJ02破碎率的影響，結果如表1所示。

表1 不同型號研磨珠研磨下酵母菌株YJ02破碎率Table 1 The yeast strain YJ02 crushing rate under different types of grinding balls

由表1可知，對于不銹鋼材料的不同型號的研磨珠，其破碎率分別為33.7%和33.3%，差別不大，而對于氧化鋯研磨珠，0.5 mm研磨珠對酵母菌株YJ02破碎率明顯高于1.0 mm研磨珠，也高于不銹鋼研磨珠，因此綜合比較后選用0.5 mm氧化鋯研磨珠用于后續酵母菌株YJ02胞內有機鋅的提取，研磨效果如圖1-c所示。

a-0.1 mm不銹鋼；b-1.0 mm不銹鋼；c-0.5 mm氧化鋯；d-1.0 mm氧化鋯圖1 顯微鏡下不同研磨珠對酵母菌株YJ02破碎情況Fig.1 Fragmentation of yeast strain YJ02 by different grinding beads under the microscope

2.2 胞內有機鋅在傳代過程中的變化

追蹤酵母菌株YJ02不同代數下的酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內有機鋅的變化情況，統計分析結果如圖2所示。

a-1號發酵車間；b-2號發酵車間圖2 酵母菌株YJ02不同代數下酵母總鋅、胞內有機鋅和酵母活力變化趨勢圖Fig.2 The trend charts of total zinc, intracellular organic zinc in yeast and yeast activity under different generations of yeast strain YJ02

對酵母菌株YJ02不同代數下的酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內有機鋅的變化情況進行相關性分析，結果如表2所示。

表2 酵母總鋅、胞內有機鋅及酵母活力與酵母菌株YJ02傳代次數相關性分析Table 2 The analysis correlation of total zinc, intracellular organic zinc in yeast,yeast activity and yeast strain YJ02 generations

注：**表示P<0.01,*表示P<0.05。

對比同一發酵車間下不同酵母菌株YJ02代數的酵母活力、酵母總鋅和胞內有機鋅可以發現，隨著酵母菌株YJ02傳代次數的增加，酵母活力整體呈現先上升后下降的趨勢，這是由于傳代初期，酵母菌株YJ02在進入新的環境中存在一定適應階段，故其整體活力增長速度較慢，隨后由于麥汁為酵母菌株YJ02生長提供了充足的營養物質，促使酵母活力快速提高，隨著傳代次數的進一步增加，酵母菌株YJ02會逐漸衰老死亡，甚至出現自溶或者變異等現象，同時由于實際生產過程中，在傳代后期會出現其他雜菌污染的情況，因此導致酵母菌株YJ02活力呈現逐漸下降的趨勢，這也與董霞等[20]研究結果一致。結合圖2和表2可以發現，酵母總鋅的含量隨傳代次數的增加呈現逐漸上升的趨勢，與傳代次數有極顯著的相關性(P<0.01)，而酵母胞內有機鋅則在一定范圍內波動，與酵母菌株YJ02傳代次數無明顯相關性，這說明在酵母菌株YJ02傳代過程中酵母總鋅含量是隨著傳代次數的增加而不斷進行累積，但酵母菌株YJ02實際可利用的有機鋅含量則是一定的，在傳代后期并不會隨著酵母活力和傳代次數的變化而發生變化。

2.3 不同麥汁鋅離子添加對酵母胞內有機鋅的影響

對發酵過程中不同鋅離子含量麥汁內CO2失重進行追蹤，結果如圖3所示。不同鋅離子含量下發酵的CO2失重量高峰期及發酵結束時間相近，0.2 mg/L的鋅離子含量下發酵高峰期失重量顯著低于其他濃度，說明較高鋅離子含量對酵母菌株YJ02發酵速率的影響不大，但過低的鋅離子含量會導致高峰期CO2失重量降低。

圖3 酵母菌株YJ02在不同鋅離子含量麥汁中的CO2失重曲線Fig.3 The CO2 weightlessness curve of yeast strain YJ02 in different zinc ion contents

于麥汁中添加不同濃度鋅離子后對酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內有機鋅含量的變化進行統計分析，結果如圖4所示。

對不同鋅離子含量麥汁發酵過程中酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內有機鋅含量的變化進行相關性分析，結果如表3所示。

由圖4可以發現，隨著麥汁中鋅離子濃度的增加，酵母活力呈現先上升后下降的趨勢，這說明在麥汁中添加低濃度的鋅離子可有效地促進酵母菌株YJ02生長繁殖，提高酵母活力，但麥汁中鋅離子濃度過高時，亦會對酵母的生長產生毒害作用，從而降低酵母活力，這也與蔣虹等[21]研究結果一致。酵母總鋅隨著麥汁中鋅離子濃度的增加逐漸上升，而酵母胞內有機鋅則先上升后趨于平穩，說明隨著外界鋅離子的不斷增加，酵母表面的無機鋅不斷富集；當鋅離子添加量小于0.6 mg/L時，酵母菌株YJ02生長實際可利用的有機鋅隨著外界鋅離子的增加而不斷增長，當麥汁中鋅離子添加量為0.6 mg/L時，酵母胞內有機鋅含量達到最大值，此時酵母活力也最強，隨后當麥汁中鋅離子含量繼續增加時，酵母胞內有機鋅含量仍然維持在80～95 mg/kg蛋白之間，說明發酵過程中酵母菌株YJ02實際可利用的有機鋅含量是有限的，并不會隨著外界鋅離子添加量的增加而不斷發生變化。在實際生產過程中酵母胞內鋅含量維持在60～95 mg/kg的水平對酵母菌株YJ02活力最有利，此時麥汁中的鋅離子含量應保持在0.4～1.4 mg/L。

圖4 不同麥汁鋅離子添加對酵母活力、酵母總鋅及酵母胞內有機鋅影響Fig.4 Effects of zinc ion addition in wort on yeast activity,total zinc and intracellular organic zinc in yeast

表3 酵母總鋅、胞內有機鋅及酵母活力與麥汁中鋅離子相關性分析Table 3 The analysis correlation of total zinc, intracellular organic zinc in yeast,yeast activity and zinc ion addition in wort

注：**表示P<0.01,*表示P<0.05。

2.4 胞內有機鋅與風味代謝物質相關性研究

發酵結束后對酵母胞內有機鋅與酵母菌株YJ02代謝過程中相關風味指標進行相關性分析(n=15)，結果如表4所示。酵母胞內有機鋅的含量與乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯及辛酸乙酯呈極顯著正相關(P<0.01)，與乙酸乙酯呈顯著正相關(P<0.05)，與甲醇、異丁醛呈極顯著負相關(P<0.01)，與醇酯比呈顯著負相關(P<0.05)，表明酵母胞內有機鋅含量的增加可以有效的促進酯類的生成，同時一定程度降低醛類、醇類的生成，從而降低醇酯比，這也與宋丹等[22]研究結果一致。酵母胞內有機鋅與二甲基硫呈極顯著正相關(P<0.01)，可能是由于而麥汁中添加少量鋅離子可有效的促進酵母菌株YJ02發酵，從而促進了二甲基硫的產生[23]。由表4可以發現,酵母活力、麥汁鋅離子濃度以及酵母總鋅與酵母胞內有機鋅相關性較弱，這也表明發酵過程中酵母菌株YJ02對鋅離子的利用不僅受到鋅離子添加量的影響，可能還受到其他因素的綜合影響。

表4 酵母胞內有機鋅與風味物質等指標的相關性Table 4 The correlation between intracellular organic zinc and flavor substances in yeast

注：**表示P<0.01,*表示P<0.05。

3 結論

研究結果顯示，隨著酵母菌株YJ02傳代次數和發酵液外源鋅離子含量的增加，酵母胞內有機鋅均呈現先上升后趨于平穩的趨勢，同時酵母胞內有機鋅與大部分脂類代謝產物呈現顯著正相關，與醛類、醇類呈現顯著負相關。結果表明酵母利用有機鋅的能力是有限的，外加鋅離子含量保持在0.4～1.4 mg/L范圍內時對酵母菌株YJ02生長最有利，且酵母胞內有機鋅可以有效地促進酯類物質的合成，并在一定程度降低醛類和醇類物質的生成，可為后續酵母發酵過程中風味物質的研究與控制提供新的參考。