配伍對(duì)川芎特征圖譜的影響及指標(biāo)成分含量變化研究

李 外，何新榮

（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院藥學(xué)部藥品供應(yīng)保障中心，北京 100853）

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，功能活血行氣，祛風(fēng)止痛[1]，為治療頭痛要藥。川芎所含生物有效成分主要包括四大類(lèi)：酚類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)（如阿魏酸）、苯酞類(lèi)化合物（如藁本內(nèi)酯）、生物堿類(lèi)（如川芎嗪）、多糖類(lèi)[2]。臨床上常與天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參等配伍用于治療各種心腦血管疾病[3-5]，如川芎配伍天麻治療偏、正頭痛，配伍細(xì)辛等用于治療諸頭痛癥，配伍丹參等治療心脈瘀阻，配伍連翹治療熱滯血瘀證，配伍赤芍等治療血瘀頭痛，配伍黨參等治療心絞痛[6-8]。因此，川芎的配伍極具研究?jī)r(jià)值，尤其是配伍理論與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)基于物質(zhì)基礎(chǔ)角度考察川芎及配伍用藥特點(diǎn)，為探討和優(yōu)化川芎中醫(yī)臨床上配伍及進(jìn)一步揭示其藥效機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，配有G1311A四元泵、G1322A脫氣機(jī)、G1329A進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；FW135中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；TP432自動(dòng)電位滴定儀（北京時(shí)代新維測(cè)控設(shè)備有限公司）；FA-1004電子天平（上海精科儀器有限公司）；YP601N電子秤（上海菁海儀器有限公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

川芎飲片（批號(hào)：16070201、16090301、17020401、17030301、18080501、18100301）、天麻飲片（批號(hào)：18033101）、細(xì)辛飲片（批號(hào)：17031102）、丹參飲片（批號(hào)：18030901）、連翹飲片（批號(hào)：17111001）、黨參飲片（批號(hào)：18052801）和赤芍飲片（批號(hào)：18081101）均購(gòu)自北京綠野藥業(yè)有限公司。中藥飲片鑒定人為我院藥學(xué)部李外副主任藥師。所有飲片分析前于40 ℃烘干至恒重，粉碎成粗粉。阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201614）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110664-201623）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為蒸餾水和三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取阿魏酸、藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，用甲醇溶解并定溶至10 mL容量瓶中，配制得阿魏酸384 μg·mL-1、藁本內(nèi)酯22 μg·mL-1的對(duì)照品母液，精密量取各對(duì)照品母液，甲醇制成每1 mL含阿魏酸380 μg、藁本內(nèi)酯0.242 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

稱(chēng)取川芎、天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參飲片若干份，每份各5 g，分成川芎、天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參單煎組和川芎-天麻、川芎-細(xì)辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參藥對(duì)組，每組各3份。置于250 mL的燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，浸泡2 h，水浴加熱，水沸后計(jì)時(shí)，1 h取出稱(chēng)重，補(bǔ)足減失的重量，趁熱抽濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得川芎、天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參單煎供試液，以及川芎-天麻、川芎-細(xì)辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參藥對(duì)配伍合煎供試液，各3份，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：InertSustainBio C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)器：DAD，檢測(cè)波長(zhǎng)為321 nm。流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，溶劑比例：0 ～ 5 min，A：5% ～10%；5 ～ 15 min，A：10% ～ 30%；15 ～ 20 min，A：30% ～40%；20 ～ 30 min，A：40% ～ 55%；30 ～ 40 min，A：55%～ 80%；40 ～ 45 min，A：80% ～ 5%。進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下川芎?jiǎn)渭骞┰嚻啡芤海础?.3”項(xiàng)下色譜條件各連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL。分別記錄阿魏酸和藁本內(nèi)酯色譜峰保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算該兩種有效成分色譜峰保留時(shí)間RSD分別為0.37%和0.45%，峰面積RSD分別為0.98%和0.92%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下川芎?jiǎn)渭骞┰嚻啡芤海謩e于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄阿魏酸和藁本內(nèi)酯色譜峰峰面積，計(jì)算該兩種有效成分色譜峰峰面積的RSD分別為1.34%和1.76%。表明川芎供試品溶液中阿魏酸、藁本內(nèi)酯在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批川芎和丹參飲片，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備川芎-丹參配伍合煎供試品溶液6份，分別按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，記錄每份樣品中阿魏酸、藁本內(nèi)酯色譜峰峰面積，計(jì)算阿魏酸、藁本內(nèi)酯的相對(duì)峰面積的RSD分別為1.66%和1.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 川芎?jiǎn)挝丁⑴湮樗帉?duì)特征圖譜的研究

2.5.1 川芎及配伍組HPLC特征圖譜的建立 按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，將6批川芎水煎煮供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)HPLC指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果，按中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）”進(jìn)行計(jì)算，分別對(duì)各批次樣品指紋圖譜進(jìn)行匹配，相似度的計(jì)算采用多點(diǎn)校正、色譜峰自動(dòng)匹配，得出相應(yīng)的對(duì)照?qǐng)D譜，選擇吸收信號(hào)較強(qiáng)、穩(wěn)定性好、峰形明顯的12個(gè)色譜峰標(biāo)定為共有峰，見(jiàn)圖1。對(duì)川芎?jiǎn)渭逡褐讣y圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，可知在45 min內(nèi)全部出峰完畢，其指紋圖譜相似度均＞0.974，指紋圖譜相似度高。

圖1 川芎水煎液HPLC特征指紋圖譜注：S1 ～ S6 - 1 ～ 6批川芎樣品；R - 對(duì)照?qǐng)D譜Fig 1 Characteristic fingerprint of chuanxiong decoction by HPLCNote：S1 ～ S6 - 1 ～ 6 batches of Chuanxiong Rhizoma samples；R -contrast chromatography

2.5.2 色譜峰的歸屬分析 在“2.3”項(xiàng)下色譜條件下，將川芎、天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參水煎煮供試品溶液以及川芎-天麻、川芎-細(xì)辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參配伍合煎煮供試品溶液以阿魏酸和藁本內(nèi)酯混合對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果對(duì)各供試品溶液中各色譜峰進(jìn)行歸屬，可以確定共有特征峰均來(lái)自各個(gè)單煎組，色譜峰的個(gè)數(shù)沒(méi)有新增加或是減少，其中8號(hào)峰為阿魏酸，12號(hào)峰為藁本內(nèi)酯，表明川芎與諸藥配伍沒(méi)有新的化合物產(chǎn)生或是消失。將川芎和川芎-天麻、川芎-細(xì)辛、川芎-丹參、川芎-連翹、川芎-赤芍、川芎-黨參藥對(duì)組的對(duì)照?qǐng)D譜疊加，見(jiàn)圖2。

圖2 川芎及配伍組HPLC指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜A - 川芎?jiǎn)渭褰M，B - 川芎-天麻組，C - 川芎-細(xì)辛組，D - 川芎-丹參組，E - 川芎-連翹組，F(xiàn) - 川芎-赤芍組，G - 川芎-黨參組；1- 阿魏酸；2 - 藁本內(nèi)酯Fig 2 Contrast chromatogram of HPLC fingerprint of Chuanxiong and compatibility groupsA - Chuanxiong Rhizoma group, B - compatibility group with Gastrodiae Rhizoma, C - compatibility group with Asari Radix et Rhizoma, D - compatibility group with Salvia miltiorrhiza Radix et Rhizoma, E - compatibility group with Forsythiae Fructus, F -compatibility group with Paeoniae Radix rubra, G - compatibility group with Codonopsis Radix; 1 - ferulic acid, 2 - ligustilide

2.6 有效成分含量變化研究

2.6.1 線性關(guān)系考察 按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品混合液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μL，進(jìn)樣，分別記錄阿魏酸和藁本內(nèi)酯峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)x，峰面積為積分值y，繪制回歸曲線，并計(jì)算阿魏酸和藁本內(nèi)酯的線性范圍。計(jì)算得阿魏酸的回歸曲線：y1= 5 193.98 x1+ 22.17，R1= 0.999 9；藁本內(nèi)酯的回歸曲線：y2= 1 773.46 x2-0.51，R2= 0.999 9。結(jié)果表明，阿魏酸和藁本內(nèi)酯分別在0.038 ～ 1.900 mg、0.242 ～ 12.100 μg濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6.2 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的同一批川芎飲片6份，每份5 g，精密稱(chēng)定，分別加入阿魏酸和藁本內(nèi)酯混合對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備川芎供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算加樣回收率。計(jì)算阿魏酸和藁本內(nèi)酯平均回收率分別為98.21%和98.50%，RSD分別為0.42%和0.37%。

2.6.3 樣品含量的測(cè)定 取“2.2”項(xiàng)下川芎的單煎液，及與天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參配伍合煎液，各3份，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL。記錄各供試品中阿魏酸、藁本內(nèi)酯的峰面積，按“2.6.1”項(xiàng)下曲線方程計(jì)算各樣品中阿魏酸、藁本內(nèi)酯的含量，各供試品煎出含量結(jié)果見(jiàn)表1。與川芎?jiǎn)渭逡航M比較，有效成分含量變化結(jié)果顯示，藥對(duì)配伍組中藁本內(nèi)酯含量均升高；細(xì)辛、丹參、赤芍、黨參與川芎藥對(duì)配伍阿魏酸的含量均升高，天麻-川芎組阿魏酸的含量降低，連翹-川芎組無(wú)顯著變化。

3 討論

3.1 川芎藥對(duì)配伍特點(diǎn)及研究思路

“藥對(duì)”配伍用藥本是中醫(yī)用藥的特色，在中醫(yī)臨床上，川芎為中藥處方中常用藥味，且在組方中常配伍丹參、細(xì)辛、天麻、連翹、赤芍和黨參等組成藥對(duì)用藥來(lái)治療各種腦血管疾病，配伍用藥的臨床案例[9-11]較多，但其配伍的基礎(chǔ)研究較少，相關(guān)研究的關(guān)注點(diǎn)多在單味藥炮制前后的成分變化，缺乏配伍后成分及有效成分煎出率的影響數(shù)據(jù)，且臨床實(shí)踐中，中藥飲片多是水煎入藥，進(jìn)入人體內(nèi)的均是能用水煎煮出來(lái)的化學(xué)物質(zhì)[12-13]。因此，本研究采用傳統(tǒng)的水煎煮方法結(jié)合現(xiàn)代精密的檢測(cè)方法，擬從有效成分煎出含量方面考察中醫(yī)配伍用藥的特點(diǎn)，能更真實(shí)挖掘川芎配伍規(guī)律與臨床藥效的關(guān)系。

表1 川芎?jiǎn)渭寮芭c羌活等藥合煎樣品中有效成分含量.mg·g-1，n = 3Tab 1 The content of effective components in single and combined decoction samples. mg·g-1, n = 3

3.2 川芎配伍研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果思考

川芎的主要化學(xué)成分為川芎嗪、阿魏酸和藁本內(nèi)酯，也是研究主要考察點(diǎn)。本研究檢測(cè)阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量變化，同時(shí)考察了川芎飲片水煎煮液中川芎嗪的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川芎嗪的含量極低。在考察其他不同的提取方法，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)不同批次原藥材中川芎嗪含量均較低。因此，本研究主要考察川芎中阿魏酸和藁本內(nèi)酯兩個(gè)藥效成分。天麻、細(xì)辛、丹參、連翹、赤芍、黨參均會(huì)影響川芎中有效成分阿魏酸和藁本內(nèi)酯的煎出量，尤其對(duì)藁本內(nèi)酯的影響顯著，配伍后藁本內(nèi)酯含量增加，勢(shì)必會(huì)增加藁本內(nèi)酯的抗動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性，因此，在臨床上表現(xiàn)出配伍增效的作用。

綜上，研究川芎與諸藥配伍，是基于真實(shí)世界研究人體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與臨床配伍的關(guān)系，以期望能為中醫(yī)臨床上組方配伍劑量比提供數(shù)據(jù)依據(jù)。有研究[14]報(bào)道，輔助用藥分類(lèi)中，以活血化瘀類(lèi)品種最多，尤其是中藥復(fù)方制劑，其不合理的配伍使用時(shí)常發(fā)現(xiàn)。基于對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的深入討論和分析，從藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)和安全用藥角度出發(fā)，建議臨床中醫(yī)師在開(kāi)具川芎飲片時(shí)，了解其配伍后有效成分的變化規(guī)律，恰當(dāng)配伍以增強(qiáng)臨床療效。另外，本研究為進(jìn)一步揭示川芎的藥效機(jī)理提供了物質(zhì)基礎(chǔ)方面的數(shù)據(jù)支持。