惡性腫瘤中MNX1反義RNA 1的作用及機制研究進展*

關滄海， 趙俞喬， 郭 靚， 陳雨竹， 王微娜， 姜興明

（哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150086）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類廣泛存在于細胞核和細胞質內、長度在200 nt 以上、缺少開放閱讀框、不參與或很少參與蛋白質編碼、主要從蛋白編碼基因的反義鏈及間隔區轉錄出來的RNA［1-6］。已有大量研究證實，lncRNA涉及調控多種生物學功能，比如細胞增殖、凋亡及血管生成［7-9］。表達異常的lncRNA與諸多腫瘤的發生發展密切相關［10-11］。lncRNA可通過調節甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑改變細胞周期和增殖免疫等在諸多腫瘤中發揮促癌或抑癌的作用［12-15］。MNX1 反義RNA 1（MNX1 antisense RNA 1，MNX1-AS1）是一種新發現的與惡性腫瘤發生發展密切相關的lncRNA。

1 MNX1-AS1概述

MNX1-AS1 全長 5 568 nt，位于 7 號染色體長臂 3區6 帶（7q36），鄰近MNX1 蛋白編碼基因的5'端，又稱結腸癌相關轉錄本5（colon cancer associated transcript 5，CCAT5）；NR_038835.1 是 MNX1-AS1 唯一的轉錄異構體，含有2 個外顯子。目前研究表明，MNX1-AS1可以借助競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制與miRNA 相互作用，參與靶基因的表達調控；誘導細胞周期相關蛋白的表達，加快腫瘤的生長；促進上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及激活 AKT/mTOR等多種信號通路來調控肺腺癌、乳腺癌和肝細胞癌等諸多惡性腫瘤的發生發展。

2 MNX1-AS1與惡性腫瘤

2.1 肺腺癌 大量研究表明，MNX1-AS1 在肺腺癌組織中表達明顯上調，高表達MNX1-AS1 患者的瘤體更大，遠處轉移發生概率更高，并且總生存時間（overall survival，OS）更短，從Cox比例風險模型的分析數據來看，MNX1-AS1 的定量檢測可以作為肺腺癌患者預后的獨立判斷因素［16-17］。通過轉染特異性siRNA 下調MNX1-AS1 表達后能夠顯著抑制A549 和SPC-A1 腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。進一步研究證實 MNX1-AS1和BRF2 的末端序列 CUUUGCA 與miR-527 的種子序列GAAACGU 存在互補；肺腺癌組織中MNX1-AS1與miR-527的表達呈明顯負相關，而與BRF2 的表達呈正向相關；預先反向上調miR-527或下調BFR2 的表達都可以逆轉MNX1-AS1 過表達所致的促癌作8 用［18］。上述研究結果提示：異常高表達的MNX1-AS1 對肺腺癌增殖與侵襲轉移的促進是通過ceRNA機制調控miR-527/BRF2軸來實現的。

2.2 胃癌 對96 例胃癌患者的腫瘤組織和臨床病理學數據的分析發現，MNX1-AS1 在腫瘤組織中異常高表達，MNX1-AS1 的表達水平與腫瘤大小、淋巴轉移、TNM 分期、長期生存情況以及預后密切相關。敲減 MNX1-AS1 后胃癌細胞 AGS和MGC-803 的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，其機制是沉默MNX1-AS1 能夠抑制反映細胞增殖能力的增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、EMT 相關蛋白神經鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）以及與腫瘤轉移有關的基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達［19］。此外，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）可以抑制CDK 活性，防止關鍵CDK 底物的磷酸化，阻滯細胞周期進展，Ma等［20］證實異常高表達的MNX1-AS1可以通過抑制CDKN1A 來促進胃癌的侵襲和遷移。由此可見，MNX1-AS1 對胃癌發生發展的調控可以通過PCNA、EMT 和細胞周期途徑，然而MNX1-AS1 是否可以借助ceRNA機制促進胃癌有待進一步研究。

2.3 結腸癌 結腸癌中MNX1-AS1 呈異常高表達，并且其表達水平不僅與淋巴轉移和臨床分期密切相關，同時還可作為結腸癌患者預后的獨立危險因素。體外細胞學實驗的結果顯示，轉染pcDNA3.1-MNX1-AS1 的結腸癌細胞 HT29 在 490 nm 波長測得的吸光度值更高，并且進入Transwell 下室的細胞不僅數目更多，侵入速度也明顯加快。通過生物信息學技術以及qRT-PCR 檢測出miR-218-5p 是在MNX1-AS1 被沉默后顯著表達的miRNA，miR-218-5p 下游靶基因SEC61 易位子 α1 亞基（SEC61 translocon alpha 1 subunit，SEC61A1）在結腸癌明顯高表達。進一步利用雙螢光素酶報告基因實驗證實miR-218-5p 與上述兩者存在靶向作用關系，并且沉默MNX1-AS1 對結腸癌的抑癌作用可以被下調miR-218-5p 或過表達SEC61A1 所逆轉。同時，研究人員還預測出轉錄因子E2F1與MNX1-AS1的啟動子區域結合，但缺少更進一步的分子細胞學實驗來證實［21］。另有研究證實，過表達的MNX1-AS1 能夠促進結腸癌細胞HT29 和SW620 中信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的表達，從而調控結腸癌的發生發展［22］。上述研究結果提示，異常高表達的MNX1-AS1 不僅可以借助miR-218-5p/SEC61A1 軸，還能激活STAT3 信號通路來促進結腸癌的增殖、遷移和侵襲，而MNX1-AS1的上游調控機制有待后續的實驗研究。

2.4 肝細胞癌 對81 例肝細胞癌患者的腫瘤組織和臨床數據進行定量檢測及分析，觀察到MNX1-AS1在腫瘤組織中的表達明顯上調并且其表達水平與患者臨床高分期、出現遠端轉移及OS 呈顯著負相關。MTT、劃痕和Transwell 實驗的結果表明，敲減MNX1-AS1后 Huh7和SMMC-7721 肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力得到增強；裸鼠移植瘤實驗也證實，沉默MNX1-AS1能夠減緩體內腫瘤細胞的生長，導致瘤體更小。為進一步研究MNX1-AS1促癌的作用機制，研究人員首先預測出MNX1-AS1 與COMMD8（COMM domain containing 8）的 3'UTR 序 列 AAGCACAA 和miR-218-5p 的種子序列UUGUGCUU 之間存在互補；抗Ago2的RNA免疫沉淀實驗表明，Ago2更容易與上述三者結合沉淀，并且在肝細胞癌組織中miR-218-5p與MNX1-AS1、和COMMD8的表達均呈負相關；轉染 sh-MNX1-AS1 對 Huh7和SMMC-7721 細胞增殖和侵襲遷移的抑制作用能被過表達COMMD8 逆轉［23］。由此可見，MNX1-AS1能夠作為“分子海綿”內源性吸附miR-218-5p，阻斷其與COMMD8 3'UTR 之間的結合，從而抑制肝細胞癌的惡性生物學行為。

2.5 食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC） 在ESCC 患者的腫瘤組織中MNX1-AS1 的表達顯著高于癌旁正常組織，MNX1-AS1 高表達組患者的5 年生存率更低。體外細胞學實驗證實 ，轉 染 si-MNX1-AS1 后 ESCC 細 胞 系 KYSE30 和KYSE150的細胞周期被阻滯，并且細胞的增殖、侵襲和遷移也受到抑制。隨后的研究表明，MNX1-AS1和miR-34a 存在靶向結合位點并且兩者表達呈顯著負相關；沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在ESCC 組織中高表達，并且轉染si-MNX1-AS1和miR-34a inhibitor 后 的 KYSE30 細 胞中SIRT1 的表達分別受到抑制和促進［24］。換言之，MNX1-AS1 可以通過 miR-34a/SIRT1 軸對 ESCC 進行調控。然而上述研究沒有證明miR-34a 和SIRT1 是否存在靶向作用關系，對于MNX1-AS1 是否借助ceRNA 機制或是其他途徑影響SIRT1 的表達有待后續研究。此外，胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）是ESCC 發生發展過程中的促癌基因。Zheng 等［25］的研究結果表明，上調 MNX1-AS1 可以促進 ESCC 細胞系 TE-1 中 IGF2 的表達，進而加快ESCC的遷移和侵襲進程。

2.6 乳腺癌 通過qRT-PCR 和統計學分析36 例乳腺癌腫瘤組織樣本和病理學數據，觀察到MNX1-AS1在乳腺癌組織中異常高表達，其表達水平不僅與組織學分級、淋巴轉移和TNM 分期密切相關，而且還可以用來評估患者的預后。細胞學實驗證實轉染siRNA-MNX1-AS1 的 MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌細胞的A值更小，劃痕條帶的間距更寬并且穿透基底膜的細胞數目更少。為探明MNX1-AS1 通過何種機制促進乳腺癌的增殖和侵襲遷移，Cheng等［26］對過表達 MNX1-AS1 后乳腺癌細胞 AKT/mTOR通路（促進細胞增殖）和EMT途徑的相關蛋白進行檢測，發現 p-AKT、p-mTOR 及其下游的 CDK4、Bcl-2、cyclin D1和c-Myc明顯高表達，且加快腫瘤侵襲和遷移的間充質標志蛋白N-cadherin、Snail和Slug的表達上調。上述結果表明，乳腺癌中異常高表達的MNX1-AS1 通過對 AKT/mTOR 信號通路和 EMT 的調控來促進腫瘤的惡性生物學行為。

2.7 骨肉瘤 研究表明MNX1-AS1 在骨肉瘤中表達顯著上調；Kaplan-Meier 分析結果顯示MNX1-AS1的表達水平與患者的總生存期呈顯著負相關；單因素和多因素分析表明定量檢測MNX1-AS1 可以對骨肉瘤患者的預后情況進行判斷。細胞實驗的結果顯示轉染siRNA-MNX1-AS1 后骨肉瘤細胞Saos-2 的增殖和侵襲能力受到抑制。研究MNX1-AS1 促癌機制的過程中檢測到吻素1（kisspeptin-1，KISS1）不僅在骨肉瘤組織中顯著低表達，而且與MNX1-AS1 的表達呈負相關，于是作者得到MNX1-AS1 通過負向調控KISS1 來增強骨肉瘤的增殖和侵襲的結論，然而該研究團隊缺少KISS1 相關表型實驗來進一步證明其在骨肉瘤起到的促癌作用［27］。另有研究證實，骨肉瘤中 N-cadherin和Snail 受 MNX1-AS1 表達的調控，通過誘導上述兩者高表達來增進上皮間質轉化從而加速骨肉瘤的發生發展［28］。此外，在骨肉瘤細胞U20S 中檢測出MNX1 的表達顯著上調并受到MNX1-AS1的正向調控，然而這種調控作用是否能夠促進骨肉瘤的發生發展以及何種機制有待深入研究。

2.8 多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM） 對44例GBM 患者的組織和臨床病理學數據進行qRT-PCR 定量檢測及分析：MNX1-AS1 在GBM中的表達顯著高于癌旁正常組織，其表達水平可以作為患者整體生存情況的獨立風險因素。體外細胞學實驗結果表明轉染過表達載體上調MNX1-AS1 后U251 和T98 腫瘤細胞的吸光度增加、遷移和侵襲加快，而上述惡性生物學行為在沉默MNX1-AS1 的情況下可以被抑制。對MNX1-AS1 促癌作用機制進行深入研究，首先通過生物信息學技術預測出MNX1-AS1 和miR-4443 存在靶向結合位點，共轉染MNX1-AS1-WT 與miR-4443 mimics 后螢光素酶活性顯著降低；miR-4443在GBM組織和T98細胞中明顯低表達，上調miR-4443 的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲遷移；沉默MNX1-AS1 對GBM 細胞惡性生物學行為的抑制作用明顯強于共轉染shRNA-MNX1-AS1和 miR-4443 inhibitor 的腫瘤細胞［29］。因此，MNX1-AS1 對膠質母細胞瘤的調控是通過競爭性結合miR-4443來實現的。

2.9 其他腫瘤 MNX1-AS1 在卵巢癌呈異常高表達，并且其表達水平與患者淋巴轉移、FIGO 分期高及5年生存率差顯著正相關，MNX1-AS1的定量檢測可以評估和預測患者的整體生存情況。CCK-8、Transwell 和流式細胞術的結果顯示，轉染pcDNA3.1載體外源性上調MNX1-AS1 后更多的卵巢癌細胞（OVCA433 和SKOV-3）進入S 期并且其凋亡發生受抑制，進而增強卵巢癌的增殖和侵襲遷移能力；沉默MNX1-AS1 后可以得到與上述相反的結果［30-31］。然而目前卵巢癌中MNX1-AS1的促癌機制還不明確。

宮頸癌中異常高表達的MNX1-AS1 與腫瘤大小、血管侵襲、FIGO 分期及淋巴轉移密切相關。過表達MNX1-AS1 能夠促進E6E7 細胞的增殖，而敲減MNX1-AS1 后測得 HeLa 細胞的A值降低；凋亡實驗和Western blot 的結果表明，過表達的MNX1-AS1 通過促進Bcl-2、抑制Bax 的表達來抑制凋亡發生。MAPK 信號通路與宮頸癌的發生發展密切相關，為證明MNX1-AS1 是否通過激活此通路起到促癌作用，研究人員首先在MNX1-AS1 過表達的E6E7 細胞中檢測到MAPK 通路相關蛋白p-ERK1/2 和p-JNK 呈高表達，隨后利用ERK1/2 和JNK1/2 的抑制劑SCH772984和SP600125證實阻斷MAPK 信號通路能夠逆轉過表達的MNX1-AS1 對宮頸癌的促進作用［32］。

MNX1-AS1 在前列腺癌組織中的表達相比于癌旁正常組織存在顯著差異（MNX1-AS1在前列腺癌中異常高表達），MNX1-AS1 高表達組患者的整體生存情況更差。細胞增殖實驗的結果表明，MNX1-AS1被敲減后DU145 與PC3 細胞的增殖和侵襲遷移顯著增強。針對MNX1-AS1 的促癌機制進一步研究證實，過表達的MNX1-AS1不僅可以誘導PCNA 表達上調進而提高前列腺癌細胞的增殖能力，還能上調EMT 相關蛋白Snail 和N-cadherin 的表達來加速腫瘤的侵襲和遷移［33］。

已有的研究顯示，膀胱癌細胞5637 中MNX1-AS1呈異常高表達；轉染sh-MNX1-AS1的腫瘤細胞A值更低，向劃痕中心的遷移速度減緩，且進入G2期的細胞比例降低；抑制MNX1-AS1 表達的移植瘤在裸鼠體內的生長速度減慢。隨后的機制研究證實，miR-218-5p與MNX1-AS1及RAB1A之間存在相同的靶向結合位點，敲減RAB1A能夠抑制5637 細胞的增殖、侵襲和遷移；過表達miR-218-5p或沉默RAB1A都可部分逆轉上調MNX1-AS1 所致的促癌作用。此外，異常高表達的MNX1-AS1 還可以促進EMT 相關蛋白的表達，進而提高膀胱癌的遷移和侵襲能力［34］。

3 總結與展望

得益于基因測序等技術的快速發展，越來越多的lncRNA 被發現，同時lncRNA 在腫瘤中的異常表達及其調控機制也被不斷揭示。lncRNA MNX1-AS1在諸多腫瘤中異常高表達，其表達水平與腫瘤病理生理學特征及患者的整體生存情況密切相關。已有的研究結果顯示，MNX1-AS1 可以通過多種方式調控腫瘤的發生發展，在結腸癌、肝癌和膀胱癌中作為miR-218-5p 的“分子海綿”調控下游促癌靶基因；在胃癌、乳腺癌和前列腺癌中促進EMT；調節胃癌、食管鱗癌和卵巢癌的細胞周期；激活結腸癌、乳腺癌和宮頸癌的 STAT3、AKT/mTOR 及 MAPK 信號通路，然而相關的上游分子機制目前還沒有報道。此外，MNX1-AS1 作為MNX1 的天然反義轉錄本是否可以通過調節MNX1 的轉錄、招募相關蛋白引起組蛋白甲基化以及其他可能的方式來促進腫瘤的發生發展，還需要進一步探索。