外周血循環腫瘤細胞數目與老年晚期非小細胞肺癌患者療效及預后的相關性

茍小麗 苑成 柏玉舉 石磊 邢時云 馬虎

(遵義醫科大學 1第一附屬醫院腫瘤科，貴州 遵義 563000；2第三附屬醫院)

肺癌是一種威脅人類健康及生命安全的主要惡性腫瘤疾病，非小細胞肺癌(NSCLC)是其常見類型，在全部肺癌患者中占比為75%～80%，現有的根治術、化療、放射治療、靶向治療、生物治療等手段應用效果均不盡人意，患者5年生存率仍低于20%，腫瘤的遠處轉移及復發是其治療失敗主要原因〔1，2〕。多數在確診時已經發展至晚期，只具備姑息放化療指征，對這類患者的化療周期制定是臨床醫生多面臨難題，對已經接受多種綜合治療的患者是否還需要維持治療也是臨床醫師所要關注的問題。可見早期評估患者治療情況及預后，對指導患者未來治療方案的制定意義重大。血行播散是惡性腫瘤轉移重要途徑，腫瘤細胞入侵血管需要多個步驟，外周血循環腫瘤細胞(CTCs)是存在于轉移瘤及原發瘤的進入血流的腫瘤細胞，該腫瘤細胞主要因診療操作或自發等原因，通過轉移灶或實體瘤釋放進入外周循環，從而形成一類細胞〔3，4〕。這類腫瘤細胞多數在進入外周血后，均會在短時間內被機體免疫系統所識別并排除，只有極少部分存活并隨血液運行，在合適的時間黏附在血管壁上，侵襲血管壁并進入到組織間質及實質，進行分裂增殖，最終形成轉移灶〔5，6〕。由上述論述可以推測外周血CTCs數目可作為晚期NSCLC患者療效及預后預測評估指標，但目前國內臨床與之相關的研究報道并不多見。本研究旨在分析老年晚期NSCLC患者CTCs數目與患者療效及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1納入對象 在征得遵義醫科大學第一、第三附屬醫院醫學倫理委員會批準同意后，選擇2016年3月至2018年3月收治的50例晚期NSCLC老年患者作為研究對象，男28例，女22例；年齡60～90〔平均(75.12±8.51)〕歲；腫瘤分期：6例ⅢA期，17例ⅢB期，27例Ⅳ期；病理類型：32例腺癌，17例鱗癌，1例大細胞癌；分化情況：5例高分化癌，18例中分化癌，27例低分化癌。全部患者及其家屬對本次研究實施的內容知情并簽署知情同意書。

1.2入選標準 (1)納入標準：①年齡≥60歲；②經組織病理學確診為NSCLC，并符合《中國晚期原發性肺癌診治專家共識(2016年版)》〔7〕中晚期NSCLC診斷標準；②符合2009年肺腫瘤TNM分期中ⅢA期、ⅢB期、Ⅳ期診斷標準〔8〕；③全部患者在入組前未接受其他局部抗腫瘤治療或全身治療；④患者預計生存時間>3個月；⑤患者入院時心、肝、腎功能檢查均正常，血常規檢查結果正常，對化療均可耐受；⑥在院接受至少2個周期的化療。(2)排除標準：①早期NSCLC患者或入院時已經接受過放射治療或化療的患者；②既往有其他惡性腫瘤疾病治療史者；③合并其他惡性腫瘤疾病者；④無可測量病灶者；⑤治療依從性差，隨訪可能小；⑥合并嚴重心肝腎等其他重要臟器衰竭者或造血系統疾病者；⑦其他對化療治療無法耐受者；⑧合并心理疾病或精神障礙等無法很好配合治療與隨訪者；⑨治療前遠處轉移者。

1.3研究方法

1.3.1治療方法 全部患者接受多西他賽+順鉑的化療方案，化療第1天給予患者多西他賽(正大天晴藥業集團股份有限公司，國藥準字H20183209)75 mg/m2靜滴，靜滴時間為1 h；化療第1～3天給予患者順鉑(貴州漢方制藥有限公司，國藥準字H20020272)25 mg/m2靜滴。以3 w作為1個治療周期，在持續化療6個周期后評估療效，并隨訪1年，評價并記錄患者預后情況(復發情況)。

1.3.2療效評估標準 全部患者在入院時接受肺部計算機斷層掃描(CT)掃描、頭部磁共振成像(MRI)、腹部彩超及全身骨掃描，明確疾病分期并評估預后。參照《實體瘤治療療效評價標準-RECIST》中相關標準評估療效〔9〕：①完全緩解：全部目標病灶完全消失，病理淋巴結縮小，各淋巴結短徑均低于1 cm，且持續至少4 w；②部分緩解：目標病灶較化療實施前明顯縮小，直徑綜合較基線減少至少30%，且持續至少4 w；③進展：以全部可測量病灶直徑之和最小值作為參照，治療結束時直徑之和相對增加超過20%或直徑之和絕對值增加超過5 mm，或有新病灶出現；④穩定：靶病灶變化情況未達到部分緩解，增加的水平也未達到進展，在部分緩解與進展之間。完全緩解+部分緩解=有效。

1.3.3預后評估 隨訪1年后，檢測并觀察患者遠處轉移及死亡情況，將隨訪發生遠處轉移或死亡者視為預后不良。

1.3.4外周血CTCs數目檢測方法 ①儀器與設備：美國楊森公司提供的血樣本儲存管、分析儀、孵育裝置、循環上皮細胞檢測試劑盒、循環細胞質控品試劑盒、緩沖液；德國吊籃式離心機，美國Thermo公司提供試管架、移液管與槍頭、渦旋混勻器、去離子水。②試驗步驟：分別在化療前、每化療2個周期后取患者肘正中靜脈采集全血7.5 ml，混勻樣本保存，在96 h內進行CTCs的采集與分析。將全血樣本離心處理后取上清液，分別向內加入緩沖液及磁顆粒并孵育，處理后吸出磁顆粒移除磁場，加入染色劑標記便于區分，使用細胞分析處理系統處理樣本并轉移至樣本盒內，后進行掃描分析，經免疫富集、熒光標記等方法進行細胞計數。③CTC篩選及分離：白細胞染色為CD45，即白細胞特有抗體；上皮細胞染色為CK，即上皮細胞特有抗體，細胞核染色及DAPI。結合特征識別CTC，系統自動標記并初步篩查，最終經資深病理科醫生進行審核與認定。

1.3.5CTCs判定標準 ①較正常細胞擁有更大的細胞體積；②細胞核增大；③細胞核大小變異大，具有多形性特點；④染色質染色有三維層次；⑤核質比增高基本接近1∶1；⑥熒光染色標記為EpCAM+CK+DAPI+CD45+。陽性結果判定：非小細胞肺癌CTCs陽性判定最佳臨界值為1個，即7.5 ml外周血中只要發現CTCs均可判定為陽性。

1.4觀察指標 治療結束時觀察化療效果，對比不同治療效果的患者CTCs數目；將隨訪1年后遠處轉移與死亡者作為預后不良組，其他作為預后良好組，對比兩組患者CTCs數目；經Spearman相關性分析檢驗外周血CTCs數目與老年晚期NSCLC患者療效及預后的相關性。

1.5統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件進行χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1療效 全部50例老年晚期NSCLC患者均接受化療治療，在化療6個周期后，完全緩解、部分緩解、進展、穩定例數分別為1例(2.00%)、15例(30.00%)、9例(18.00%)、25例(50.00%)，有效率為32.00%(16/50)。

2.2隨訪結果 50例患者化療期間均無死亡病例，化療結束隨訪1年，50例患者中12例發生遠處轉移，轉移率為24.00%，10例死亡，死亡率為20.00%，預后不良22例，占比44.00%；其他28例患者均為預后良好組。

2.3不同治療效果CTCs陽性檢出結果 化療實施前50例患者基線評估CTCs陽性率為40.00%(20/50)，化療6個周期后，其CTCs陽性率為26.00%(13/50，安全緩解0例，部分緩解2例，進展8例，穩定3例)，較化療前顯著降低，且化療后CTCs陽性率多見于病情進展或穩定患者，差異有統計學意義(χ2=20.900,P<0.001)。

2.4不同預后CTCs陽性檢出結果 隨訪1年后，預后不良組患者CTCs陽性率〔40.91%(9/22)〕顯著高于預后良好組〔14.29%(4/28)〕，差異有統計學意義(χ2=4.539,P=0.33)。

2.5老年晚期NSCLC患者外周血CTCs陽性率與療效、預后相關性分析 外周血CTCs陽性率與老年晚期NSCLC患者療效呈負相關(r=-0.487，P<0.001)，即隨著患者CTCs陽性率越高，患者療效越差。外周血CTCs陽性情況與老年晚期NSCLC患者預后呈負相關(r=-0.301，P=0.333)，即隨著CTCs陽性率越高，患者預后越差。

3 討 論

在全部惡性腫瘤疾病中，肺癌的患病率及死亡率均居榜首，現已成為主要的惡性腫瘤疾病之一，每年新增病例數及死亡人數在全部惡性腫瘤疾病中占比分別為12.7%、18.2%〔10〕。NSCLC是肺癌常見的類型，其早期無典型癥狀，侵襲能力強，多數患者在確診時病情已發展為中晚期，甚至部分患者已經發生遠處轉移，錯失最佳的手術機會，這就決定了化療在晚期NSCLC治療中的重要地位〔11〕。通常，NSCLC患者對化療藥物敏感度多為中度，化療的有效率在30%～50%，無病進展期一般為6～9個月〔12〕。

因腫瘤細胞主要經淋巴道及血道轉移，故腫瘤的轉移復發多與循環內腫瘤細胞有關，故推測化療結束后監測患者外周血中殘余腫瘤細胞可評估其預后。目前，化療已經成為晚期NSCLC患者基本且重要的治療手段之一，以鉑類為基礎的二聯化療方案已成為晚期NSCLC患者標準治療方案，患者化療近期效果理想，且毒副反應較其他方案更輕微，患者對化療方案的耐受性有所提高〔13〕。轉移是腫瘤化療失敗主要原因，是一個多步驟、多階段且復雜的病理過程，由原發瘤或轉移瘤脫落腫瘤細胞進入淋巴系統或血流中，后形成CTCs，為惡性腫瘤細胞的轉移發展及增殖創造了條件〔14〕。因CTCs來源于腫瘤組織，故其數量在一定程度上可以直接反映晚期NSCLC患者體內腫瘤的負荷情況〔15〕。Xu等〔16〕在2015年使用相關系統對66例NSCLC患者外周血CTCs進行檢測，結果顯示，陽性率為71.21%，提示外周血CTCs陽性情況可能與患者惡性程度有關。故推測可將外周血CTCs用于老年晚期NSCLC患者化療效果及預后的評估。RECST實體瘤療效評估依然是晚期NSCLC患者化療效果主要評價標準，該標準根據患者局部病灶、遠處轉移病灶及區域淋巴結變化情況判定效果〔17〕。本研究結果顯示，外周血CTCs的動態監測較其他手段用于老年晚期NSCLC患者化療療效評估敏感度較高，利于指導患者化療早期方案的更改，對避免患者承受不必要的過渡治療或無效治療意義重大。此外，本研究還觀察了老年晚期NSCLC患者外周血CTCs陽性率與預后的相關性。腫瘤的遠處轉移及患者生存情況均是預后判斷重要因子，機體內淋巴通道及循環系統均是腫瘤細胞達到遠處器官重要途徑，腫瘤細胞需要經過淋巴循環或血液循環才可到達各臟器中定植增殖，從而形成新的病灶，故檢測惡性腫瘤疾病患者的循環細胞數目是評估是否發生遠處轉移的關鍵〔18〕。本研結果顯示外周血CTCs數目的監測可以考慮作為老年晚期NSCLC患者預后的評價指標。因本研究樣本量不足，加之受研究時間及研究條件的限制，獲得的結果可能存在偏移，得到的結論也可能有其不足，故還應在未來開展大樣本、多中心、前瞻性、長時間的研究加以證實。

綜上所述，外周血CTCs在老年晚期NSCLC中的表達情況與患者化療效果、遠處轉移及死亡風險密切相關，可將外周血CTCs陽性數目與腫瘤標志物聯合使用，以為未來老年晚期NSCLC患者的療效及預后評估提供依據。