趨化因子受體CCR7依賴的樹突狀細胞遷移的調控機制①

程玉潔 劉 娟 (海軍軍醫大學免疫學研究所暨醫學免疫學國家重點實驗室，上海 200433)

樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是連接天然免疫和獲得性免疫的關鍵橋梁，DC的功能調控決定了免疫應答的整體平衡。DC廣泛分布于淋巴及非淋巴組織，它的體內遷移對于其成熟活化及功能調控至關重要[1]。DC體內遷移受到趨化因子及趨化因子受體相互作用的精密調控。趨化因子CCL19/CCL21作用于DC表面的CCR7，引導DC最終遷移到外周免疫器官，對激活T細胞介導的免疫應答及維持免疫耐受都發揮重要作用[2,3]。

穩態情況下，非淋巴組織的未成熟DC(immature DC，imDC)經歷自發的成熟過程，形成半成熟DC(semimature DC，smDC)。病原體或炎癥信號刺激后，imDC活化為成熟DC(mature DC，mDC)。半成熟DC和mDC上調趨化因子CCR7(C-C chemokine receptor type 7)，在趨化因子CCL19和CCL21(C-C motif chemokine 21)的作用下沿著淋巴管遷移，并穿過被膜下淋巴竇(subcapsular sinus，SCS)，進入引流淋巴結[4,5]。CCL21的另外一個受體為非典型趨化因子受體4(atypical chemokine receptor 4，ACKR4)。ACKR4表達于SCS的內皮細胞表面，與CCL21結合后可以捕獲并內吞降解CCL21，從而在淋巴結中形成一個朝向T細胞區CCL21的濃度梯度，最終將DC趨化至T細胞區，進一步激活T細胞介導的獲得性免疫應答[6,7]。除外CCR7，其他的趨化因子受體也被證實參與影響DC的體內遷移。如皮膚受過敏原刺激后，CD301b+DC顯著上調CCR8并在CD169+SIGN-R1+巨噬細胞分泌的CCL8的刺激下遷移至淋巴組織，繼而活化Th2細胞最終激發過敏性免疫應答[8]。本文重點討論CCR7信號介導的DC遷移及其調控機制。

1 CCR7依賴DC遷移的信號活化機制

CCR7是一種七次跨膜的G蛋白偶聯受體，CCL19和CCL21是CCR7僅有的配體，DC通過細胞膜上的CCR7感知淋巴管中的細胞因子濃度梯度而精準定向遷移。有研究表明CCR7對CCL19的反應可能比CCL21的反應時間更短，且只有CCL19可以有效地刺激CCR7磷酸化和內化，導致受體脫敏[9]。體外實驗中觀察到細胞對低濃度的CCL19和CCL21表現出相似的敏感性，但是當細胞同時暴露于CCL21和CCL19相同梯度甚至相反梯度時，細胞會優先向CCL21方向遷移。這一現象可能與CCL21與基質蛋白多糖和信號緊密結合，不需要內化有關[10]。然而在體內情況下，CCR7如何區分識別CCL19和CCL21來源的趨化信號以調節DC遷移和免疫應答尚不清楚。

CCR7信號活化與蛋白質翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)密切相關。聚唾液酸化是將多聚唾液酸連接到糖苷上的過程，由多聚唾液酸轉移酶ST8Sia Ⅱ和ST8Sia Ⅳ介導。研究表明，St8sia4酶缺失后，小鼠淋巴結體積明顯變小，DC遷移能力幾乎消失。進一步研究發現，DC的CCR7分子能夠攜帶聚唾液酸，CCL21的C端與唾液酸結合后能夠解除其全長的自我抑制，促進CCR7和CCL21有效結合，觸發遷移過程和炎癥應答[11]。此外，多個胞內蛋白對于促進CCR7介導的遷移信號和適應性免疫活化有重要作用，如磷脂酰肌醇3激酶PI3Kγ(phosphatidylinositol 3-kinase-γ)[12]、糖基磷脂酰肌醇錨蛋白Sema7A(GPI-anchored protein semaphorin 7A)[13]、白三烯C4轉運體(leukotriene C4 transporter，MRP1)[14]等。由于CCR7信號活化觸發的DC遷移在免疫應答中的關鍵作用，機體需要復雜的胞內調控機制調節CCR7信號，確保DC受病原體刺激后能夠快速動員并到達次級淋巴結，而在遷移后期能夠及時“剎車”，以調節免疫活化及免疫耐受的平衡。研究表明，骨架收縮、代謝平衡、表觀調控等胞內過程在CCR7信號及DC遷移過程中發揮多樣化的調控作用，影響免疫應答的最終效應。

2 CCR7依賴的DC遷移的信號調控機制

2.1骨架收縮 細胞骨架是細胞維持形態、運動、功能的重要成分。骨架收縮不僅提供了細胞運動的原動力，也在多個層面發揮了調控作用。肌球蛋白收縮和肌動蛋白的聚合是細胞遷移的基本特征和動力。肌動蛋白在頭部聚集，肌球蛋白在尾部收縮，以維持肌動蛋白的逆流，產生細胞與環境之間的摩擦力，使得細胞朝著頭部方向運動，該過程決定了細胞極性和運動的方向[15]。上述機制是免疫細胞遷移過程中骨架重塑的一般性特征，但是DC又有其獨特的方式。

imDC在攝取抗原之后成熟活化，形成mDC并攜帶抗原遷移至淋巴結，進而刺激獲得性免疫應答的發生。研究表明，mDC比imDC表達更高水平的CCR7，從而對趨化因子受體CCL19/CCL21的反應性更高。除此之外，細胞內是否存在其他機制導致imDC和mDC對趨化因子的反應方式不同，從而決定imDC和mDC的遷移特征？近期研究表明，imDC的遷移依賴兩種肌動蛋白(actin)調節機制，一種是細胞尾部RhoA-mDia1依賴的actin池，用來促進細胞向前運動，一種是細胞頭部Cdc42-Arp2/3依賴的actin池，用來抑制細胞遷移但促進抗原攝取。當DC成熟后，Arp2/3依賴的actin明顯減少，Rho依賴的actin明顯增多，使得mDC降低抗原攝取能力，并快速、持續地往淋巴結遷移[16]。因而，骨架系統能夠根據DC的不同成熟狀態及需求進行重塑，進而決定其遷移類型。該課題組對該過程的胞內信號基礎繼續深入探索，發現DC完成攝取抗原刺激后，巨胞飲降低，誘導離子通道蛋白TRPML1(transient receptor potential cation channel,mucolipin subfamily,member 1)表達上調，TRPML1繼而誘導溶酶體鈣流上升，活化細胞尾部肌動蛋白和肌球蛋白重組，繼而促進遷移。溶酶體鈣流通過轉錄因子TFEB誘導TRPML1轉錄，形成正反饋調節[17]。該研究表明溶酶體信號可以通過調控細胞骨架，促進病原體信號和遷移信號的交叉調節，促進DC高效工作，吞噬抗原后立刻向淋巴結遷移。因而，DC遷移的時機、極性、速度都受到骨架系統的靈活調控。在DC中，尾部的actin聚集可以產生快速的定向遷移，而頭部的actin聚集引發的是一種慢速遷移。

2.2代謝調控 代謝作為細胞中一種極為敏感而靈活的反應系統對細胞表型和功能有明顯影響。DC表達大量不同類型的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)及細胞因子受體，感知特定的病原體模式分子或環境細胞因子改變，從而誘導炎癥反應。不同類型和功能狀態下的DC有著十分多樣的、動態的代謝特征，以維持細胞能量和物質需求，保證DC的分化和功能穩定[18]。靜息狀態時，DC主要通過氧化磷酸化和脂肪酸氧化獲得能量。在TLR(Toll-like receptors)刺激后，DC短時內迅速上調糖酵解速率并通過活化誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)誘導一氧化氮(NO)的產生而下調氧化磷酸化水平[19,20]。糖酵解的增強不僅為DC活化供能，產生的檸檬酸鹽也可以作為體內合成游離脂肪酸的前體，促進高爾基體和內質網的合成以產生和分泌DC活化途徑中所需要的蛋白質，這一過程依賴于胞內TBK1/IKKε/Akt通路傳遞信號[21]。漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)在干擾素誘導劑的作用下氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)和脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，FAO)活化上調并產生干擾素發揮抗病毒功能，通過CCR9傳遞外周抗原的作用在胸腺內誘導免疫耐受的形成[22]。另外，在營養缺乏，乳酸、腺苷等代謝物堆積等情況下，DC會出現一些致耐受的表型，產生TGF-β、IL-10等免疫抑制成分，表達調節性DC(regulatory DC)的特征。此時，腺苷通過誘導AMPK，抑制糖酵解，促進氧化磷酸化，抑制DC活化。

淋巴組織處于低氧環境，而低氧狀態對DC分化發育和功能的發揮影響顯著。缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α)與炎癥發生發展密切相關[23]。在常氧情況下，缺氧誘導因子HIF-1α被pVHL結合從而發生降解。此時葡萄糖攝入后轉化為丙酮酸，因氧氣充足，丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，促進線粒體氧化磷酸化。而缺氧情況下，HIF-1α活化入核，與HIF-1β及p300/CBP形成復合體，誘導糖酵解基因表達，引起糖酵解加強，乳酸堆積。HIF-1α還能夠抑制PDH而降低乙酰輔酶A生成，抑制氧化磷酸化，并且促進琥珀酸鹽的富集[24]。近期研究表明抑制糖酵解會損害DC樹突形狀延長、活力的維持、CCR7寡聚和向引流淋巴結遷移的能力。體內實驗表明，無論DC受何種因素激活，胞內誘導糖酵解對其遷移運動的支持和CCR7寡聚都是必要的[25]。然而，CCR7信號激活通過何種機制觸發DC糖酵解，DC遷移過程中HIF-1α具體發揮了怎樣的作用、受到何種調控并影響炎癥進展過程尚不清楚。

2.3表觀修飾 DC表面模式識別受體快速識別和響應來自入侵病原體或自身受損細胞的信號，活化后觸發下游的信號轉導，選擇性地誘導基因活化或沉默，調控免疫應答的最終效應[26,27]。表觀遺傳調控包括DNA甲基化、染色質組蛋白翻譯后修飾、核小體重塑、非編碼RNA等機制，共同調控染色質結構和功能，調節基因表達。組蛋白修飾發生快速且動態可逆，可以在刺激信號到達細胞膜表面幾分鐘內在染色質上出現繼而消失，影響免疫細胞的分化或功能[28]。

在肺臟組織中，cDC前體(pre-cDCs)來源的cDC高表達CCR7并高效介導DC遷移至淋巴結，而單核細胞來源的DC(moDC)細胞膜上表達的CCR7較低，因而moDC難以從肺部遷移至淋巴結，而是在肺臟局部發揮介導過敏和炎癥反應的作用。深入研究表明，肺臟cDC和moDC的CCR7表達及趨化功能差異受到表觀修飾的調節。cDC和moDC的CCR7基因啟動子的H3K27me3(trimethylation of histone 3 lysine 27)水平存在差異。這種CCR7基因表觀修飾差異在細胞發育早期尚未形成，而是在單核細胞向moDC分化的過程中逐漸形成的[29]。然而是何種因素導致了組蛋白修飾的改變，該現象的發生是DC對肺臟局部免疫微環境的被動適應，還是譜系分化過程中其他因素導致的主動改變尚無明確答案。此外，組蛋白甲基轉移酶Ezh2(methyltransferaseEnhancer of zeste homolog 2)通過對核外骨架結合蛋白(talin)的直接甲基化破壞了其與肌動蛋白的結合從而調控細胞的黏附和遷移[30]。因而，組蛋白修飾酶對于非組蛋白的修飾可能對DC遷移調控也發揮了重要調節作用。

長鏈非編碼RNA(long non coding RNA，lncRNA)是一類具有廣泛生物學功能的非編碼RNA，通過多種作用機制調控胞內信號，與細胞分化發育、周期調控等眾多生命活動密切相關。近年來研究表明，lncRNA在免疫細胞發育和免疫應答過程中發揮著重要的作用。我們的研究發現，lnc RNA Dpf3可以阻礙CCR7依賴的DC的遷移，其機制為Dpf3直接結合HIF-1a并抑制其所誘導的糖酵解功能，調控下游信號轉導和蛋白間相互作用[31]。

3 DC遷移與自身免疫性疾病

DC作為天然免疫和獲得性免疫的連接橋梁，與自身免疫性疾病及免疫相關性疾病的發生發展密切相關。DC通過參與胸腺T細胞陰性選擇，使其獲得對自身抗原的耐受從而維持機體多數狀態下的免疫穩態[32]。imDC或調節性DC能夠誘導T細胞失能或凋亡、促進調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)細胞生成和功能等，維持外周耐受[33]。當免疫穩態被打破，將觸發免疫系統針對自身組織或細胞進行免疫應答，誘導自身免疫性疾病的發生[34]。如NF-κB信號一直被認為是促炎相關的核轉錄因子，近期研究表明該通路中一個重要的活化因子IKKβ對于穩態情況下的DC朝向淋巴結的遷移和聚集有重要作用，能夠誘導Treg細胞的分化，促進免疫耐受的形成。敲除IKKβ后，小鼠穩態DC遷移和Treg細胞生成明顯降低，自身免疫性疾病發生概率明顯上升[35]。

越來越多的研究表明DC遷移紊亂可能導致DC在炎癥部位的過度聚集及活化，導致組織過度炎癥，甚至引發自身免疫性疾病。CCL19/CCL21被證明與多種自身免疫性疾病如多發性硬化(multiple sclerosis，MS)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)及炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)等的發生發展密切相關。CCL19/CCL21或其受體CCR7的基因缺失小鼠中實驗性自身免疫性腦脊髓炎、抗原誘導的關節炎發病明顯減弱，且DC介導的Th1及Th17細胞活化顯著降低。因此CCL19/CCL21依賴DC遷移及功能活化對于維持免疫應答及免疫調控的動態平衡發揮關鍵作用。在小鼠實驗中，抑制劑FTY720通過減少CCL19分泌和降低DC上CCR7功能顯著抑制膠原誘導性關節炎的發生率和嚴重程度[36]。因此，DC相關趨化因子及趨化因子受體可能成為自身免疫性疾病的潛在診斷標識和治療靶點。

4 討論與展望

2011年，諾貝爾生理與醫學獎授予了三位在天然免疫領域做出杰出貢獻的免疫學家。其中，Steinman等[37]，DC的發現者，在DC的生理功能、臨床應用等方面做出了突出貢獻。1972年發現DC以來，對DC發育分化、功能調控、臨床應用的研究不斷取得突破[37]。2010年4月29日，由美國Dendreon公司生產的DC疫苗Provenge成為首個被美國FDA批準正式上市的治療性腫瘤疫苗，并用于晚期尤其是對激素療法失效的前列腺癌患者[38]。此外，CCR7在多種腫瘤如乳腺癌、非小細胞肺癌等癌癥中表達，這種在免疫細胞和腫瘤細胞中共同表達的特點可能成為DC疫苗腫瘤治療的新靶點[39]。可以看出，DC的理論和轉化醫學研究在認識免疫應答根本原理、攻克重大免疫相關疾病中發揮了重要作用。

然而DC領域仍然有許多懸而未決的重要科學問題亟待進一步研究。DC的分類是否可以更加細化、定居外周的DC亞群和遷移性的DC亞群在早期是如何劃分的、DC遷移過程是否受到未知代謝物的調控、在穩定狀態和炎癥狀態過程中的DC遷移存在哪些不同，這些領域都等待進一步探究。相信隨著研究的深入，以DC為基礎的細胞免疫療法將在自身免疫性疾病、感染性疾病和腫瘤等疾病的治療與干預中發揮更加重要的作用。