銀杏酮酯對抑郁大鼠腦內ERK1/2及其磷酸化水平的影響①

李 寧 周珊珊 胡 蕊 高媛媛 王潮敏 王育梅

(河北醫科大學第一醫院精神衛生科，石家莊 050000)

抑郁癥是情緒障礙綜合征，嚴重影響人們身心健康，且具有較高致死率。抑郁癥發病時主要通過慢性應激導致前額葉與海馬為主的腦區中神經元細胞損傷甚至凋亡，從而損害患者認知功能[1,2]。細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)作為絲分裂活化蛋白激酶通路的主要組成部分，具有抵抗細胞損傷與促進生長的作用，其表達水平影響患者的行為能力，與抑郁癥的發生、發展密切相關[3]。銀杏酮酯(ginkgo biloba extract,GBE)作為新型銀杏葉提取物制劑，主要成分為銀杏黃酮與銀杏內酯，能改善模型大鼠抑郁樣行為，抑制NLRP3炎癥小體活性，減少促炎癥因子分泌[4,5]。本實驗采用慢性輕度不可預見性應激配合分養建立抑郁大鼠模型，給予不同劑量GBE干預，通過比較各個實驗組大鼠前額葉與海馬ERK1/2 mRNA與蛋白表達及其磷酸化水平，探討銀杏酮酯對抑郁大鼠行為學的保護作用及其影響機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 SPF級SD大鼠50只，雄性，體重180～220 g，由河北醫科大學提供，合格證號：SYXK(冀)2013-0023。除對照組外，其余各組單籠分養，室溫下適應性飼養1周，自由攝食與飲水。銀杏酮酯(上海杏靈科技藥業有限公司)；ERK1/2、p-ERK1/2激酶活性定量檢測試劑盒(美國Cell Signaling公司)；β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立 采用慢性輕度不可預見性應激配合分養法建立抑郁大鼠模型[6,7]。造模前對各組大鼠進行曠場試驗、糖水消耗試驗。造模大鼠單籠飼養，每天隨機接受1種不同刺激，包括2 h束縛行為、45°傾籠、24 h濕籠、連續5次/1 min電擊足底30次、4℃冰水游泳5 min、4℃熱水游泳5 min、夾尾5 min、24 h禁水、24 h禁食、晝夜顛倒24 h，連續造模21 d。

1.2.2分組與給藥 將大鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、銀杏酮酯低、中、高劑量組，每組10只。除對照組外，模型組與銀杏酮酯低、中、高劑量組大鼠均進行造模處理。造模成功后，銀杏酮酯低、中、高劑量組大鼠分別灌胃50、100、200 mg/(kg·d)的銀杏酮酯，連續給藥28 d。對照組與模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.3糖水消耗試驗 撤去食物和水，于籠子中央放置相同體積1%蔗糖水和飲用水，觀察大鼠5 h自由飲水情況。5 h后交換蔗糖水與飲用水位置，繼續觀察大鼠5 h，計算糖水攝入百分比：攝入蔗糖水百分比=蔗糖水量/(蔗糖水量+飲用水量)×100%。

1.2.4曠場試驗 采用80 cm×80 cm×60 cm的不透明墻壁組成的立方體箱。試驗于上午7:30～ 12:00安靜環境下進行。記錄大鼠10 min內行程(水平運動)、后肢直立次數(垂直運動)，行為學得分=水平運動得分+垂直運動得分。每次實驗徹底清潔曠場后再進行下一只大鼠的觀察。

1.2.5ERK1/2、p-ERK1/2 mRNA表達水平的檢測 各組大鼠腹腔注射給予20%烏拉坦(劑量5 mg/kg)麻醉，斷頭取腦，于冰面小心剝離腦組織，分離前額葉與海馬，分別依次加入1 ml Trizol溶液，制作成組織勻漿。提取樣品總RNA，檢測濃度與純度，逆轉錄成cDNA。每個樣本中加入ERK1/2引物，同時進行PCR擴增，反應條件為95℃預變性5 min；95℃變性15 s，55℃退火32 s，72℃延伸32 s，重復40個循環；72℃延伸5 min，ERK1/2 mRNA 5′-CGTTCAGATGTCGGTGTC-3′；5′-AAAGGAGTCAAGAGTGGG-3′，β-actin 5′-GCCGGGAA-ATCGTGCGTGACATT-3′；5′GATGGAGTTGAAGGTAG-TTTCGTG-3′。

1.2.6ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平的檢測 各組大鼠腹腔注射給予20%烏拉坦(劑量為5 mg/kg)麻醉，斷頭取腦，于冰面剝離腦組織，分離海馬，冰浴下制成10%的組織勻漿，于4℃下3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，按試驗試劑盒說明書測定蛋白表達情況。

2 結果

2.1糖水消耗試驗結果 給藥前，模型組、銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠蔗糖水攝入百分比顯著低于對照組(P<0.05)。給藥后，模型組大鼠蔗糖水攝入百分比顯著低于對照組大鼠(P<0.05)；與模型組比較，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠蔗糖水攝入百分比顯著升高(P<0.05)。給藥后各組大鼠蔗糖水攝入百分比顯著高于給藥前(P<0.05)。見表1。

2.2大鼠曠場試驗結果 給藥前，模型組、銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠曠場試驗得分顯著低于對照組(P<0.05)。給藥后，模型組大鼠曠場試驗得分顯著低于對照組大鼠(P<0.05)；與模型組比較，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠曠場試驗得分顯著升高(P<0.05)。給藥后各組大鼠曠場試驗得分顯著高于給藥前(P<0.05)。見表2。

2.3ERK1/2、p-ERK1/2 mRNA表達水平測定結果模型組大鼠前額葉與海馬p-ERK1/2 mRNA的表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠p-ERK1/2 mRNA的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；各組間ERK1/2 mRNA的表達水平不存在顯著差異(P>0.05)。見表3與圖1。

GroupsnPercentage of sucrose water intakeBefore administrationAfter administrationControl1083.36±7.3282.95±5.66Model1058.72±4.311)60.56±7.321)50 mg/(kg·d)GBE1060.41±5.201)72.80±5.612)3)100 mg/(kg·d)GBE1060.38±7.621)75.52±6.402)3)200 mg/(kg·d)GBE1059.41±5.841)80.12±4.372)3)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with before administration,3)P<0.05.

GroupsBefore administrationAfter administrationControl90.80±3.6192.20±2.30Model21.00±1.241)20.90±2.601)50 mg/(kg·d)GBE22.10±3.421)39.00±4.922)3)100 mg/(kg·d)GBE20.60±2.161)60.00±2.712)3)200 mg/(kg·d)GBE21.40±2.781)79.90±6.152)3)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05;compared with before administration,3)P<0.05.

GroupsERK1/2 mRNAPrefrontal lobeHippocampusp-ERK1/2 mRNAPrefrontal lobeHippocampusControl0.445±0.0450.521±0.0700,614±0.0420.780±0.034Model0.420±0.0710.559±0.1040.240±0.0141)0.212±0.0461)50 mg/(kg·d)GBE0.442±0.0540.562±0.0620.521±0.0932)0.613±0.0412)100 mg/(kg·d)GBE0.449±0.0800.541±0.0780.550±0.1042)0.687±0.0722)200 mg/(kg·d)GBE0.453±0.0520.545±0.9070.603±0.0752)0.731±0.0442)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

GroupsERK1/2 proteinPrefrontal lobeHippocampusp-ERK1/2 proteinPrefrontal lobeHippocampusControl0.517±0.0980.553±0.0620.478±0.0560.581±0.073Model0.537±0.1040.572±0.0910.201±0.0341)0.248±0.0301)50 mg/(kg·d)GBE0.554±0.0870.558±0.0730.354±0.0732)0.448±0.0832)100 mg/(kg·d)GBE0.523±0.0720.569±0.1220.405±0.0982)0.537±0.0512)200 mg/(kg·d)GBE0.530±0.1310.544±0.1140.432±0.0732)0.552±0.0592)

Note：Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.

2.4ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達水平測定結果 模型組大鼠前額葉與海馬p-ERK1/2 蛋白的表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，銀杏酮酯低、中、高濃度組大鼠p-ERK1/2 蛋白的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；各組間ERK1/2 蛋白的表達水平不存在顯著差異(P>0.05)。見表4與圖2。

圖1 各組大鼠前額葉與海馬的ERK1/2與p-ERK1/2 mRNA表達(Western blot)Fig.1 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in prefrontal and hippocampus lobe among each group(Western blot)Note:1.Control;2.Model;3.GBE low dose;4.GBE medium dose;5.GBE high dose.

圖2 各組大鼠前額葉與海馬ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(Western blot)Fig.2 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 protein in perfrontal lobe and hippocampus among each group(Western blot)Note:1.Control;2.Model;3.GBE low dose;4.GBE medium dose;5.GBE high dose.

3 討論

應激是心理疾病發生的促成因素，可引起機體內分泌失調以及神經化學變化，抑郁癥的發生與應激密切相關[8]。本研究采用慢性輕度不可預見性應激聯合孤養建立抑郁癥動物模型，經過長期無規律的刺激，使大鼠處于心理紊亂狀態。葡萄糖作為神經元的主要能力來源，當神經元細胞受到損傷，對葡萄糖的吸收減少，葡萄糖攝取量的減少降低了神經元細胞所需的能量，進一步加深了細胞損傷[9]。通過行為學評分表明，模型大鼠蔗糖攝入百分比、曠場試驗得分均低于對照組大鼠，反映大鼠的興趣與興奮度減弱，與抑郁患者臨床癥狀相符[10]，說明造模取得成功。

前額葉主要控制情緒變化和記憶學習能力，特別對快樂的獲得功能。海馬是調節情緒的重要腦區，也是應激損傷的主要易感部位，慢性應激主要通過HPA-Glu-NMDAR路徑對其結構損害[11]。前額葉和海馬區作為與記憶、學習等認知能力密切相關的腦區，在應激過程中最容易受到損害。前額葉與海馬神經細胞信號轉導通路異常，發生退行性變化，使得神經元細胞受損，容易引起抑郁發生[12]。因此，本研究選取前額葉與海馬腦區觀察ERK1/2的表達情況。銀杏酮酯能夠降低血清皮質酮濃度，抑制血清和海馬炎癥細胞因子的含量，具有緩解模型抑郁樣行為的功效[13,14]。有研究表明，銀杏酮酯對神經元有一定的保護作用[15]。ERK1/2大量存在于前額葉皮質和海馬中，主要調節細胞的增殖和分化，磷酸化ERK1/2是其活化的形式。本研究結果表明，低、中、高劑量的銀杏酮酯均可提高前額葉與海馬的p-ERK1/2 mRNA和蛋白表達水平，說明銀杏酮酯可以通過上調前額葉與海馬ERK1/2磷酸化水平，對神經元細胞起到一定保護作用，緩解應激導致的抑郁樣行為。