不同遺傳背景對C5aR在銀屑病病理中作用的影響①

徐 砜 鄭權友 李桂清 陳 戩 許桂蓮 (陸軍軍醫大學基礎醫學院免疫學教研室,重慶 400038)

銀屑病是一類慢性反復發作的皮膚炎癥性疾病，大多在40歲以下發病，其流行性分布隨著地理區域的分布及人種類別的差異而有所不同[1]。在銀屑病的發病機制中，目前認為是免疫細胞與上皮細胞相互作用的結果[2]。其中，最為重要的是IL-23/IL-17通路產生的IL-17，IL-17作用于角質形成細胞產生銀屑病相關分子從而導致該病的發生發展[3,4]。多種類型的免疫細胞可分泌IL-17，且最近研究發現，分泌IL-17γδT細胞亞群與Th17亞群有近乎相同作用，在銀屑病中它們也被統稱為“T17”[5,6]。因此，分泌IL-17的γδT細胞的頻率也可作為銀屑病疾病程度的監測指標之一[7,8]。

Greb等[1]報道了在世界上不同地區人群中銀屑病的發病率存在差異，即銀屑病的發生與遺傳因素相關。人類皮膚和小鼠皮膚在結構上非常相似，小鼠的皮膚下有環狀的毛囊、表皮更新較快，皮膚中有γδT淋巴細胞的存在，采用小鼠來模擬人的皮膚病模型已經很成功地被應用在銀屑病的研究當中[9,10]。同時，實驗發現C5aR基因敲除后，咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎明顯減輕(SCI論著在投中)，但未比較不同遺傳背景下C5aR在銀屑病病理發生中的作用。本研究通過咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠模型，比較了C5aR+/+BALB/c、C5aR-/-BALB/c、C5aR+/+C57BL/6和C5aR-/-C57BL/6 4組小鼠病情的嚴重程度，探討了C5aR基因缺陷在不同遺傳背景下對咪喹莫特誘導的銀屑病病情的影響。

1 材料與方法

1.1材料 雌性8～12周齡SPF(specific-pathogen-free)級C57BL/6以及BALB/c小鼠均購自北京華阜康生物科技有限公司；C5aR-/-BALB/C小鼠[C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J]購自JACKSON實驗室；C5aR-/-C57BL/6小鼠為本實驗室構建(C5aR-/-BALB/c小鼠和C5aR+/+C57BL/6小鼠雜交，然后將所得雜合子C5aR+/-再與C5aR+/+C57BL/6小鼠回交連續12代以上，再將雜合子C5aR+/-自交，篩選出C5aR-/-子代，即C5aR-/-C57BL/6小鼠)。所有實驗小鼠均飼養于陸軍軍醫大學免疫學研究所SPF級層流動物房，自由飲食飲水至合適周齡，備用。TRIzol試劑盒、遞轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；RPMI1640培養基購自Hyclone公司；Ⅳ型膠原酶、Ionomycin、Invitrogen購自Sigma公司；熒光標記抗體購自Ebioscience公司；流式細胞儀購自BD FACS CantoⅡ公司。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及銀屑病模型的建立 小鼠分為4組：C5aR+/+BALB/c (5只/組)、C5aR-/-BALB/c(4只/組)、C5aR+/+C57BL/6(5只/組)和C5aR-/-C57BL/6(4只/組)小鼠組。4組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉后，剃刀刮除右側背部皮膚被毛，形成約3 cm×2 cm的裸露皮膚區域。剔除被毛24 h 后在小鼠背部皮膚裸露區涂抹等量 (60 mg/d) 的咪喹莫特乳膏 (四川明欣利迪藥業有限公司)，連續給藥5 d，最后一次給藥24 h后處死小鼠并取材。

1.2.2小鼠銀屑病樣皮損的評價 按照PASI標準，于每日給藥前觀察小鼠背部皮膚裸露區并評分，根據皮損處紅斑(erythema，E)、浸潤(infiltration，I)、鱗屑(scales，S)三項指標由輕至重按照0～4分的標準進行評分并相加得到總分。繪制隨時間變化的評分曲線。

1.2.3小鼠皮損局部組織HE染色 小鼠斷頸處死后，于背部皮損局部隨機取2塊皮膚組織，經4 %多聚甲醛固定后，行脫水、石蠟包埋、切片處理，按照HE染色的操作步驟進行染色。每個樣本隨機選取兩張切片進行HE染色，每張切片隨機選取3個視野進行拍照，對表皮棘層的增生層數進行分析。

1.2.4熒光定量PCR 利用TRIzol試劑盒提取小鼠誘導銀屑病后皮損組織中的總RNA，以逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA后，應用熒光定量PCR試劑盒進行擴增，檢測小鼠誘導銀屑病后皮損組織中IL-17的表達。引物序列如下：β-actin上游引物：5′-ATGACCCAAGCCGAGAAGG-3′，下游引物：5′-CGGCCAAGTCTTAGAGTTGTTG-3′；IL-17上游引物：5′-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3′，下游引物：5′-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3′。

1.2.5流式細胞儀檢測小鼠皮膚局部組織IL-17A+γδT細胞亞群的浸潤 小鼠斷頸處死后，取1 cm×1 cm 皮膚組織置于1.5 ml EP管中，充分剪碎至勻漿，加入2.5 mg/ml的Ⅳ型膠原酶后于37℃搖床消化1.5 h，過濾，1 800 r/min離心后以1 ml RPMI1640 培養基重懸細胞，加入PMA(10 ng/ml)和Ionomycin(250 ng/ml)和BFA(Invitrogen 1 000×)1 μl，于CO2孵箱培養4 h。收集細胞后，加入抗CD3、γδTCR和IL-17A的熒光標記抗體，流式細胞儀檢測目的亞群百分比。細胞因子的刺激和胞內阻滯以及染色的具體方法見文獻[11、12]。

1.2.6流式細胞儀檢測小鼠引流淋巴結中IL-17A+γδT細胞亞群的百分比 小鼠斷頸處死后，剪開腋下皮膚暴露皮下淋巴結，取出淋巴結后置于70 μm篩網 (Falcon) 上輕柔研磨，并加入PBS緩沖液沖洗，離心后用RPMI1640 培養基重懸細胞,同上述方法加入PMA、Inomycin和BFA刺激胞內因子的分泌并阻滯在胞內,流式細胞儀檢測目標亞群的百分率。

2 結果

2.1與相應BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠銀屑病樣皮炎表型減輕 圖1A顯示在使用咪喹莫特乳膏連續5 d涂抹于4組小鼠背部皮膚后，誘導出嚴重程度不同的銀屑病樣皮炎表型。在相同遺傳背景下，與C5aR+/+小鼠相比，C5aR-/-小鼠的皮損情況均有所減輕；在不同遺傳背景下，C5aR+/+和C5aR-/-C57BL/6小鼠較相應BALB/c小鼠皮損情況減輕 (圖1A)。圖1B顯示依據PASI評分標準，在咪喹莫特給藥1 d后開始，根據4組小鼠背部皮膚紅斑、鱗屑、浸潤的嚴重程度進行評分后累加并記錄，繪制隨天數增加的評分曲線圖，比較4組小鼠皮損的總體差異。在相同遺傳背景下，C5aR-/-小鼠的PSAI評分均較C5aR+/+小鼠低(P<0.05)；不同遺傳背景條件下,C57BL/6背景的C5aR+/+和C5aR-/-小鼠較BALB/c背景的相應小鼠PASI評分均顯著降低(圖1B，P<0.05)。與BALB/c小鼠相比，C57BL/6遺傳背景的C5aR+/+小鼠和C5aR-/-小鼠咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎顯著減輕。

2.2與相應BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠銀屑病樣皮炎的表皮組織較薄、 表皮增生程度較輕 圖2A為BALB/c和C57BL/6小鼠皮膚組織的HE染色結果，圖2B為經Image J軟件測量小鼠炎癥表皮厚度的結果。從4組小鼠皮膚組織的HE染色及皮膚表皮組織的半定量分析結果可以發現：4組小鼠在咪喹莫特干預后，表皮棘層有不同程度的增厚。在不同遺傳背景下，與相應BALB/c小鼠相比，C57BL/6背景的C5aR+/+小鼠與C5aR-/-小鼠表皮棘層增厚程度均較輕(圖2)。

圖1 不同遺傳背景(BALB/c 和 C57BL/6)小鼠對咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎敏感性的比較Fig.1 Comparison of IMQ-induced psoriasis skin infla-mmation in BALB/c and C57BL/6 backgro-und miceNote: A.The BALB/c strain mice and C57BL/6 strain mice back psoriasis-like skin inflammation induced by IMQ for 5 days；B.The PASI scores of four groups mice.C5aR+/+ mice，n=5;C5aR-/-mice，n=4，*.P<0.05.

圖2 銀屑病樣皮炎小鼠背部皮膚組織的HE染色Fig.2 HE staining of back skin lesion sections in mice with psoriatic-like skin inflammationNote: A.HE staining of psoriatic-like skin inflammation sections on day 5(×100)；B.The epidermis thickness of psoriasis-like skin mice,n=5;C5aR-/- mice,n=4，*.P<0.05.

圖3 銀屑病樣皮炎小鼠背部皮膚組織中IL-17A mRNA的表達水平Fig.3 mRNA levels of IL-17A in back skin lesion sections in mice with psoriasis-like skin inflammationNote: A.The IL-17 mRNA levels in back skin tissues were compared between C5aR+/+ and C5aR-/-mice with both BALB/c and C57BL/6 background；B.The IL-17 mRNA levels in back skin tissues were compared between BALB/c and C57BL/6 mice.C5aR+/+ mice,n=5;C5aR-/-mice,n=4.The values were presented as 1.

圖4 流式細胞儀分析銀屑樣皮炎小鼠背部皮損局部和引流淋巴結中IL-17A+γδT細胞的百分率Fig.4 Percentage of IL-17A+γδT cells in back skin lesion tissues and draining lymphnodes in mice with psoriasis-like skin inflammation by FACSNote: A-C.Percentages of IL-17A+γδT cells in back skin lesions tissues of C5aR+/+ and C5aR-/- mice；D-F.Percentages of IL-17A+γδT cells in draining lymphnodes of C5aR+/+ and C5aR-/-mice.C5aR+/+ mice，n=5;C5aR-/-mice，n=4.The values were presented as

2.3與相應BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠銀屑病樣皮損局部IL-17 mRNA水平減少 Teunissen等[3]報道銀屑病皮膚組織中IL-17 mRNA水平是反映疾病嚴重程度的指標之一。為了進一步驗證4組小鼠皮膚組織中IL-17 mRNA的表達情況，我們提取了4組小鼠誘導銀屑病后的皮膚組織的總RNA，通過qRT-PCR檢測皮膚局部的IL-17 mRNA的表達情況。如圖3A所示，在相同遺傳背景下，C5aR-/-小鼠皮膚局部的IL-17 mRNA的相對表達量均低于C5aR+/+小鼠(BALB/c小鼠：P<0.05；C57BL/6小鼠：P<0.05)。如圖3B所示，在不同遺傳背景下，與BALB/c小鼠相比，C57BL/6 小鼠皮膚組織中IL-17 mRNA的表達顯著減少(C5aR+/+小鼠：P<0.000 1； C5aR-/-小鼠：P<0.000 1)。

2.4與相應BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠皮損局部組織和引流淋巴結中γδT細胞百分比顯著降低 將4組小鼠誘導銀屑病后的皮膚組織消化收集細胞懸液、染色、流式細胞儀檢測γδT細胞的百分率。結果如圖4A所示，在4組小鼠皮膚組織中的IL-17A+T淋巴細胞中，γδT細胞所占比例有所不同。在不同遺傳背景下(圖4B)，C57BL/6小鼠的IL-17A+γδT細胞百分率較BALB/c 小鼠顯著減少(C5aR+/+小鼠：39.68% 65.52%，P<0.05；C5aR-/-小鼠：24.55% 53.23%，P<0.05)；在相同遺傳背景下(圖4C)，C5aR-/-小鼠IL-17A+的γδT細胞百分率較同背景的C5aR+/+小鼠顯著減少(BALB/c 背景：53.23%、65.52%，P<0.05；C57BL/6背景：24.55%、39.68%,P<0.05)。同時，將4組小鼠誘導銀屑病后的右側腋窩淋巴結取樣，經研磨、染色后流式細胞儀檢測，得到類似的結果(圖4D～F)，即4組小鼠的IL-17A+γδT細胞亞群百分率的變化與背部皮損組織浸潤的IL-17A+γδT細胞趨勢一致。

3 討論

銀屑病被認為是一類與自身免疫系統失調相關的自身免疫性疾病。目前的研究認為，分泌IL-17的γδT細胞為該病發揮效應的主要細胞類型[13]。

Giacomassi等[14]揭示了補體系統在小鼠銀屑病模型中的重要作用。本實驗室前期研究發現，C5aR基因缺陷小鼠可顯著衰減咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎(未發表結果，投稿中)。雖然有報道較之于C57BL/6小鼠，BABL/c背景的小鼠更易產生炎癥較重而且鱗屑較多的皮炎表型，但并未對其進行分子或細胞學方面的對比[15]。本研究為進一步研究小鼠遺傳背景對該病動物模型的影響，比較了C5aR+/+BALB/c、C5aR-/-BALB/c、C5aR+/+C57BL/6和 C5aR-/-C57BL/6 4組小鼠對咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎的敏感性。結果觀察到，4組小鼠均成功誘導銀屑病樣皮炎，但不論是C5aR+/+或 C5aR-/-小鼠，C57BL/6背景的小鼠均比BALB/c背景小鼠表型較輕；皮炎組織的病理切片也提示上述同樣的結果。該結果進一步證實了Giacomassi等[14]的研究報道，補體系統的確在銀屑病的發病中起到十分重要的作用，且遺傳背景會影響小鼠對銀屑病炎癥反應的敏感性。

Han等[16]研究證實C5aR在膿毒血癥中對γδT細胞具有調節性作用，我們的結果也顯示，在皮膚組織局部浸潤的淋巴細胞中，相同遺傳背景下，C5aR-/-小鼠均比C5aR+/+小鼠的皮膚組織局部IL-17A+γδT細胞的比例顯著降低。而且基因表型相同，遺傳背景不同的條件下，C57BL/6小鼠的皮膚組織局部γδT細胞比例均較低，同時相應皮膚組織局部的IL-17mRNA相對表達量也較低。在C57BL/6小鼠中，γδT細胞的比例較少，從而導致IL-17分泌較少，對表皮角質形成細胞的刺激較輕，因此炎癥程度較輕。

綜上所述，本研究結果表明：不同遺傳背景的小鼠對于咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮炎的敏感性不同，與相應BALB/c小鼠相比，C5aR-/-和C5aR+/+C57BL/6小鼠敏感性均相對較低，且BALB/c背景的小鼠更容易也更適合建立銀屑病動物模型，這一研究為銀屑病動物模型的建立提供了指導意義。