下調miR-217抑制類風濕性關節炎患者外周血單個核細胞炎癥反應的實驗研究

郭淑芳 姜婷婷 (延安大學醫學院，延安 716000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA) 是一種臨床常見的自身免疫性疾病，主要特征為關節慢性滑膜炎癥[1]。RA患者在發病后兩年內即可出現不可逆的關節損害，嚴重影響患者的生活質量[2]。單核/巨噬細胞是RA滑膜組織以及關節液中數量最多的免疫細胞，通過分泌活性因子、抗原提呈等調節免疫功能[3]。單核/巨噬細胞過度活化導致滑膜慢性炎癥，其還能分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，加劇炎癥反應，促進RA患者病情的惡化[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性的非編碼小分子單鏈RNA，長度為18～25個核苷酸，在炎癥反應、固有免疫以及腫瘤發生和發展等生物學過程中起重要的調節作用[5-7]。研究顯示，miR-217在乙醇誘導的肝細胞中表達上調，下調miR-217表達可抑制乙醇誘導的肝臟炎癥[8]。miR-217在高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞(RMC)中表達上調，miR-217基因沉默可抑制高糖培養的大鼠RMC細胞炎癥反應和纖維化[9]。目前，miR-217對RA患者PBMC細胞炎癥反應的影響還未見報道。本研究分離培養RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導PBMC細胞產生炎癥反應，探討miR-217對RA患者PBMC細胞炎癥反應影響及其作用機制，為RA的臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 人AB血清購自上海素爾生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑和反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自TaKaRa公司；引物序列由上海生物工程公司設計提供；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天公司；轉染相關miR-217陰性對照、miR-217 mimics等均購自Ambion公司；沉默信息調節因子2相關酶1(sirutuin1，Sirt1)抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。LipofectamineTM2000試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司；熒光素酶檢測試劑盒購自漢恒生物工程(上海)有限公司。

1.2方法

1.2.1RA患者PBMC細胞的分離培養 RA患者診斷標準根據2010年美國風濕病學會(ACR)和歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)的RA分類標準[10]。參照文獻[11]方法分離培養RA患者PBMC細胞。采集RA患者外周靜脈血，應用淋巴細胞分離液采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，使用AB血清和DMEM培養基培養。

1.2.2細胞轉染 PBMC細胞接種于24孔板中，LPS預刺激24 h后PBS清洗2次。采用Lipofecta-mineTM2000轉染試劑說明書進行轉染。分別將anti-NC(陰性對照)、anti-miR-217轉染至PBMC細胞，分別anti-NC組和anti-miR-217組；pcDNA3.1(陰性對照)、pcDNA3.1-Sirt1轉染至PBMC細胞，分為pcDNA3.1組和pcDNA3.1-Sirt1組。轉染后培養6 h，更換含10%AB血清的DMEM培養基繼續培養24 h，收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.3ELISA法檢測炎癥因子表達 PBMC細胞接種于24孔板中，培養24 h后，收集細胞培養上清液。參照TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10試劑盒操作說明，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定細胞培養上清液中其表達水平。

1.2.4qRT-PCR檢測miR-217和Sirt1 mRNA表達 取各組細胞，加入Trizol試劑，提取總RNA。微量核酸儀檢測RNA純度的濃度。A260/A280的比值在1.8～2.0用于反轉錄。使用反轉錄試劑盒進行反轉錄，PCR試劑盒進行擴增。擴增條件，95℃預變性5 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行45個循環。miR-217以U6為內參，Sirt1以GAPDH為內參，采用 2-ΔΔCt法計算miR-217和Sirt1 mRNA的相對表達水平。

1.2.5Western blot檢測Sirt1蛋白表達 取各組細胞，加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白質，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳。分離后的蛋白質電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入Sirt1抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，加入HPR標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ECL顯影液，避光顯影。Bio-Rad Chemi DOC MP全能型成像分析系統拍照，以GAPDH為內參，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 PBMC細胞接種于24孔板中，細胞融合至50%時，更換無血清DMEM培養基。采用LipofectamineTM2000分別共轉染WT-Sirt1、MUT-Sirt1與miR-NC或miR-217 mimics。每組設置3個復孔。轉染培養6 h，更換含10%AB血清的DMEM培養基繼續培養至48 h，按照雙熒光素酶報告基因實驗試劑盒操作說明書，檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1LPS誘導的PBMC細胞炎癥因子表達 以未受LPS誘導的PBMC作為對照，ELISA法檢測PBMC炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 蛋白分泌水平。結果顯示，與對照組比，LPS刺激組PBMC細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，IL-10蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，說明LPS誘導加劇了PBMC的炎癥反應。見表1。

2.2LPS誘導的PBMC細胞中miR-217和Sirt1表達 以未受LPS誘導的PBMC細胞作為對照，qRT-PCR檢測PBMC細胞中miR-217和Sirt1 mRNA表達，Western blot檢測Sirt1 蛋白表達，結果顯示，與對照組比，LPS誘導組PBMC細胞中miR-217表達水平顯著升高(P<0.05)，Sirt1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，說明LPS刺激后，PBMC中miR-217呈高表達，Sirt1呈低表達(P<0.05)。見圖1。

2.3下調miR-217表達對LPS誘導的PBMC細胞炎癥因子表達的影響 轉染anti-NC、anti-miR-217至PBMC細胞，qRT-PCR檢測miR-217表達，結果顯示，anti-miR-217組PBMC細胞中miR-217表達水平顯著低于anti-NC組(P<0.05)，說明miR-217低表達的PBMC細胞構建成功，見圖2。ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白表達。結果顯示，與anti-NC組比，anti-miR-217組PBMC細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，IL-10蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，說明下調miR-217表達可抑制LPS誘導的PBMC細胞炎癥反應，見表2。

GroupsTNF-αIL-1βIL-6IL-10Control1.21±0.570.43±0.120.53±0.145.13±0.92LPS6.59±1.112.17±0.851.39±0.622.16±0.45t12.9356.0814.0598.700P<0.001<0.0010.001<0.001

圖1 LPS對PBMC細胞中miR-217和Sirt1表達的影響Fig.1 Effect of LPS on expression of miR-217 and Sirt1 in PBMC cellsNote: Compared with control group, *.P<0.05.

2.4Sirt1過表達對LPS誘導的PBMC細胞炎癥因子表達的影響 轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-Sirt1至PBMC細胞，Western blot檢測Sirt1蛋白表達，結果顯示，pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細胞中Sirt1蛋白水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，說明Sirt1過表達的PBMC細胞構建成功，見圖3。ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白表達，結果顯示，與pcDNA3.1組比，pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著降低(P<0.05)，IL-10表達顯著升高(P<0.05)，說明Sirt1過表達可抑制LPS誘導的PBMC細胞炎癥反應，見表3。

圖2 miR-217抑制劑轉染效果驗證Fig.2 Verification of transfection effect of miR-217 inhibitorNote: Compared with anti-NC group, *.P<0.05.

GroupsTNF-αIL-1βIL-6IL-10anti-NC6.46±1.092.11±0.831.41±0.582.04±0.44anti-miR-2171.35±0.640.59±0.150.61±0.175.01±0.86t12.1285.4063.9719.223P<0.001<0.0010.001<0.001

圖3 Sirt1過表達載體的轉染效果驗證Fig.3 Verification of transfection effect of Sirt1 overex-prssion vectorNote: Compared with pcDNA3.1 group, *.P<0.05.

2.5miR-217靶向調控Sirt1表達 Target Scan靶基因預測工具顯示，Sirt1基因的3′-UTR區域存在miR-217的結合位點。雙熒光素酶報告基因結果顯示，WT-Sirt1+miR-217組PBMC細胞熒光素酶活性顯著低于WT-Sirt1+miR-NC組(P<0.05)，而MUT-Sirt1+miR-217組與MUT-Sirt1+miR-NC組熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，說明miR-217靶向調控Sirt1表達。分別將miR-217 mimics、anti-miR-217轉染至PBMC細胞，Western blot檢測Sirt1蛋白表達。結果顯示，miR-217組PBMC細胞中Sirt1蛋白表達顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-217組PBMC細胞中Sirt1蛋白表達顯著高于anti-NC組(P<0.05)，說明miR-217在PBMC細胞中負向調控Sirt1表達。見圖4。

表4 下調Sirt1表達降低了下調miR-217對LPS誘導的PBMC中炎癥因子表達的影響

Tab.4 Down-regulating Sirt1 reduces effect of down-regulating miR-217 on expression of inflamma-tory factors in LPS-induced PBMC

GroupsTNF-α(ng/ml)IL-1β(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-10(ng/ml)LPS+anti-miR-217+si-NC1.28±0.640.57±0.130.69±0.195.06±0.87LPS+anti-miR-217+si-Sirt15.46±0.972.05±0.761.29±0.483.57±0.52t10.7915.7583.4874.410P<0.001<0.0010.003<0.001

2.6上調miR-217表達抑制了Sirt1過表達對LPS誘導的PBMC中炎癥因子表達的影響 分別將miR-NC、miR-217 mimics與pcDNA3.1-Sirt1共轉染至PBMC細胞，qRT-PCR檢測miR-217表達，結果顯示，miR-217+pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細胞中miR-217表達顯著高于miR-NC+pcDNA3.1-Sirt1組(P<0.05)，見圖5。ELISA法進一步檢測兩組PBMC細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白表達，結果顯示，與miR-NC+pcDNA3.1-Sirt1組相比，miR-217+pcDNA3.1-Sirt1組PBMC細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達顯著升高(P<0.05)，IL-10表達顯著降低(P<0.05)，說明上調miR-217表達可降低Sirt1過表達對LPS誘導的PBMC細胞中炎癥因子表達的影響，見表4。

3 討論

RA是一種自身免疫性疾病，目前，其發病原因尚不十分清楚，普遍認為其發生與機體炎癥反應、免疫功能紊亂等因素關系密切[12]。miRNA可通過與靶mRNA結合，降解或抑制靶mRNA翻譯，在細胞發育、增殖、凋亡等生物學過程中發揮關鍵調控作用。研究顯示，大量miRNA在RA患者機體內異常表達，參與RA疾病的發生、發展[13-15]。通過調控miRNA干預網絡，可影響RA炎癥、免疫、疼痛等多種病理過程，是治療RA的新思路[16]。彭桉平等[17]發現雷公藤內酯醇可通過抑制miR-155表達下調LPS誘導的RA患者單核細胞炎癥反應。朱亞梅等[18]研究發現清絡通痹方可能通過影響膠原性關節炎(CIA)小鼠miR-143等miRNA的表達，參與CIA炎癥、免疫等過程，是治療RA的潛在方法。探討RA患者機體內異常表達的miRNA及其作用機制，有助于深入了解RA的發病機制，為其治療提供新的策略。

miR-217定位于人2號染色體，參與多種疾病的發生和發展。徐建等[19]研究發現miR-217在食管鱗癌組織和細胞中表達上調，下調其表達可抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。劉宇等[20]研究發現，高糖誘導的內皮細胞中miR-217表達紊亂，miR-217參與內皮細胞的凋亡。目前，miR-217在RA中的研究尚未有報道。細胞發生炎癥反應時，促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌增加，抗炎因子IL-10分泌減少[21]。本研究分離了RA患者PBMC細胞，采用LPS誘導PBMC細胞產生炎癥反應，以未受LPS誘導的PBMC細胞作為對照，ELISA法檢測結果顯示，LPS誘導后，PBMC細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平升高，IL-10分泌水平降低，說明LPS誘導PBMC細胞產生了炎癥反應。qRT-PCR檢測結果顯示，LPS誘導后，PBMC細胞中miR-217呈高表達，提示miR-217參與PBMC細胞的炎癥反應。通過轉染anti-miR-217至PBMC細胞，下調miR-217表達后，LPS誘導的PBMC細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平降低，IL-10分泌水平升高，說明下調miR-217表達可抑制RA患者PBMC細胞炎癥反應，miR-217是RA治療的潛在靶點。

通過miRNA靶標預測軟件顯示，Sirt1基因的3′-UTR區域存在miR-217的結合位點，miR-217可能調控Sirt1表達。Sirt1是一種蛋白去乙酰化酶，定位于細胞核，可通過抑制核因子κB(NF-κB)的轉錄活性，進而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細胞因子的產生[22]。本研究結果顯示，LPS誘導的PBMC細胞中Sirt1 mRNA和蛋白均表達下調，與蔡國偉等[23]報道的RA患者膝關節滑膜組織Sirt1蛋白表達減少的結果一致，提示Sirt1在RA疾病的發生和發展過程發揮重要作用。本研究雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染WT-Sirt1與miR-217的PBMC細胞熒光素酶活性顯著共轉染WT-Sirt1與miR-NC的PBMC細胞，而共轉染MUT-Sirt1與miR-217的PBMC細胞熒光素酶活性與共轉染MUT-Sirt1與miR-NC的PBMC細胞無明顯差異，證實miR-217在PBMC細胞中可靶向調控Sirt1表達。這與俞峰等[24]報道的高糖誘導的內皮細胞中miR-217靶向調控Sirt1表達結果一致。進一步將miR-NC、miR-217 mimics轉染至PBMC細胞，Western blot檢測結果顯示，miR-217組PBMC細胞中Sirt1蛋白表達顯著低于miR-NC組，說明miR-217在PBMC細胞中負向調控Sirt1表達。ELISA法檢測結果顯示，LPS誘導后，Sirt1過表達的PBMC細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平顯著降低，IL-10蛋白水平顯著升高，說明Sirt1過表達可抑制LPS誘導的PBMC細胞炎癥反應。而與共轉染miR-NC與pcDNA3.1-Sirt1的PBMC細胞相比，共轉染miR-217與pcDNA3.1-Sirt1的PBMC細胞TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平顯著升高，IL-10蛋白水平顯著降低，說明上調miR-217表達可降低Sirt1過表達對LPS誘導的PBMC細胞中炎癥因子表達的影響，提示下調miR-217可能通過調控Sirt1表達抑制RA患者PBMC細胞炎癥反應。

綜上所述，miR-217在LPS誘導的RA患者PBMC細胞中高表達，下調miR-217表達可能通過調控Sirt1表達抑制PBMC細胞的炎癥反應，為RA的臨床治療提供了潛在靶點。