人羊膜細胞的免疫調(diào)節(jié)作用①

程亞偉 羅 熠 王諾鑫 肖建輝

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，遵義市醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，遵義 563003 )

近年來，從人羊膜分離的羊膜細胞在再生醫(yī)學領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。人羊膜細胞除了具備干細胞的多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)特性外，還具有獲取方便、無侵入性操作損傷、無倫理道德問題等優(yōu)勢，為再生醫(yī)學的發(fā)展提供新的細胞來源。2007年，第一屆胎盤來源干細胞的國際研討會明確了胎盤可獲取干細胞的4個區(qū)域、細胞類型、分離方法及基本特征，其中人羊膜細胞包括人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)和人羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細胞(human amniotic mesenchymal stromal cells,hAMSCs)[1]。hAECs表達CD324、CD29、CD73、CD136、SSEA-4和OCT-4，不表達CD14和CD45；hAMSCs表達經(jīng)典的間充質(zhì)細胞表面標志物CD90、CD44、CD73和CD105[1]。更重要的是，hAECs和hAMSCs均低表達HLA-A，B，C，不表達HLA-DR[1]，表明這兩種細胞具有免疫豁免特性，移植入體內(nèi)無免疫排斥反應(yīng)。

羊膜具有維持胎兒耐受母體免疫的特性，能夠抑制固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]。事實上，hAECs和hAMSCs在臨床前研究中，已經(jīng)取得了良好的疾病治療效果[3-6]。關(guān)于干細胞如何促進受損組織修復(fù)和再生的研究很多，其中一種理論認為，移植入體內(nèi)的細胞通過分化為特定類型細胞來替換受損組織[7,8]。然而，移植入體內(nèi)的羊膜細胞，僅少數(shù)細胞歸巢至受損組織且存活，但仍有良好的治療效果[9,10]。這些發(fā)現(xiàn)改變了羊膜細胞基于分化為特定類型細胞替換受損組織的認識，進一步認識到羊膜細胞具有改善受體免疫微環(huán)境的能力。

在炎癥持續(xù)惡化的疾病中，抑制炎癥發(fā)展是治療疾病的必要條件。研究表明，有些干細胞分泌的生物活性介質(zhì)能調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，抑制損傷后激活的免疫反應(yīng)以促進受損組織的修復(fù)和再生[11-13]。目前，hAECs和hAMSCs已廣泛應(yīng)用于治療炎癥性疾病模型，如肝纖維化、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、自身免疫性腦脊髓炎等[3,6,9,14,15]。這些研究在不同的疾病模型中均取得了令人鼓舞的治療效果，為人羊膜細胞用于炎癥性疾病的臨床治療奠定了基礎(chǔ)。人羊膜細胞在炎癥性疾病治療中涉及的免疫調(diào)節(jié)主要包括兩個方面：對免疫細胞自身演化及增殖的影響和對免疫相關(guān)細胞因子分泌的調(diào)節(jié)(圖1)。為此，本文就人羊膜細胞對免疫細胞和相關(guān)細胞因子分泌的影響進行了綜述。

1 免疫系統(tǒng)的基本功能

機體免疫系統(tǒng)除了具有識別和清除外來抗原外，還能監(jiān)控體內(nèi)突變的腫瘤細胞、衰老細胞和其他有害成分。此外，免疫系統(tǒng)也有助于促進創(chuàng)傷愈合[16]。但是，當機體的免疫平衡被打破時，可以觸發(fā)慢性和急性炎癥。例如，當免疫系統(tǒng)失去區(qū)分潛在有害的外來抗原和自身抗原的能力時，就可能引起自身免疫反應(yīng)。據(jù)估計，自身免疫性疾病，如1型糖尿病、炎癥性腸病和類風濕性關(guān)節(jié)炎，影響全球人口的7.6%～9.4%[17]。除自身免疫反應(yīng)外，免疫系統(tǒng)在細胞、器官以及組織工程構(gòu)建體移植中也起著重要作用。因此，基于人羊膜細胞的免疫調(diào)節(jié)特性，能夠干預(yù)免疫應(yīng)答過程以達到治療效果，對于預(yù)防或逆轉(zhuǎn)免疫介導的炎癥性反應(yīng)至關(guān)重要。

2 人羊膜細胞對免疫細胞及相關(guān)細胞因子分泌的影響

2.1人羊膜細胞對中性粒細胞的影響 在炎癥發(fā)展過程中，中性粒細胞首先游離到炎癥部位，其可持續(xù)釋放氧化劑和蛋白酶，導致宿主組織持續(xù)性炎癥和損傷不愈。因此，減少中性粒細胞向損傷部位遷移，及時清除炎癥部位的中性粒細胞，對損傷修復(fù)至關(guān)重要。在HSV-1誘導的小鼠角膜炎模型中，人羊膜移植能減少中性粒細胞的趨化和活化水平，并促進浸潤性中性粒細胞的凋亡和巨噬細胞對其的吞噬作用，降低角膜基質(zhì)部位炎性因子IL-2、TNF-α、IL-1α以及趨化因子CXCL1水平[18]。有研究表明，hAECs能減少中性粒細胞向肺內(nèi)浸潤[19]，并通過表達FasL介導中性粒細胞凋亡[20]。而且，凋亡的中性粒細胞還能釋放含有Annexin-1的微粒，這是一種對中性粒細胞具有抗遷移作用的蛋白[21]。因此，中性粒細胞凋亡可以進一步抑制中性粒細胞的遷移和募集。

中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)的過量釋放與自身免疫性和慢性炎癥性疾病的發(fā)展有關(guān)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，hAMSCs能釋放TSG-6蛋白，參與抑制中性粒細胞釋放活性氧(reactive oxygen species,ROS)和NETs，從而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)[23]。Nicholls等[24]利用流式細胞術(shù)與免疫熒光檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)hAMSCs高表達CD200。CD200與其受體結(jié)合，具有抑制巨噬細胞和中性粒細胞等髓系細胞功能，以及促進原始T細胞分化為調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)[25]。并且，將hAMSCs移植入大鼠腦缺血性損傷模型中，能增加大鼠體內(nèi)抗炎因子TGF-β和IL-10的水平，減少促炎細胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α及趨化因子MCP-1和GRO-α的表達，從而緩解大鼠的腦缺血性損傷。有趣的是，缺氧環(huán)境能進一步增強hAMSCs緩解大鼠腦缺血性損傷的效果[24]。這些研究結(jié)果提示，人羊膜細胞能夠以中性粒細胞為靶標，抑制中性粒細胞向炎癥部位的遷移和活化，促進其凋亡，減輕炎癥的發(fā)生發(fā)展。

2.2人羊膜細胞對抗原遞呈細胞的影響 抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell,APC)，如樹突狀細胞(dendritic cell,DC)、單核/巨噬細胞和B淋巴細胞在機體炎癥過程中被募集到炎癥部位，對免疫識別和應(yīng)答起重要調(diào)控作用。APC功能的抑制，不僅能減輕由APC引起的炎癥刺激，還能減少免疫細胞向炎癥部位的趨化，抑制免疫反應(yīng)的進一步激活。有研究表明，人羊膜細胞可以抑制APC的招募和成熟。在多發(fā)性硬化小鼠模型中，移植hAECs可以減少單核/巨噬細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤，緩解疾病的進程[9]。將人羊膜細胞與單核細胞共培養(yǎng)，能顯著抑制DC成熟標志物CD83和CD1a的表達，減少促炎性因子IL-8、CXCL9、MAP-1α、IL-12p40和IL-12p70的水平，增加抗炎因子IL-10、MIC-1和PGE2的分泌[26,27]。值得注意的是，不同的微環(huán)境也能影響hAMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力。如Pianta等[28]發(fā)現(xiàn)，子癇患者的hAMSCs和正常hAMSCs均能抑制單核細胞向DC和M1-型細胞方向分化，減輕炎癥反應(yīng)的進一步激活，然而，來自子癇患者的hAMSCs表現(xiàn)出更強的免疫調(diào)節(jié)效果。

2.3人羊膜細胞對單核吞噬細胞的影響 單核吞噬細胞包括血液中的單核細胞和組織器官中的巨噬細胞。一般來說，極化的巨噬細胞通常被稱為M1-和M2-巨噬細胞，是兩種主要且功能相反活化狀態(tài)的巨噬細胞。其中，M1-巨噬細胞通過產(chǎn)生促炎性細胞因子、趨化因子和ROS來協(xié)調(diào)炎癥期，消除損傷的起始因素；M2-巨噬細胞能夠縮短炎癥期，促進組織形成與修復(fù)[29]。諸多研究表明，調(diào)節(jié)巨噬細胞的增殖和分化是人羊膜細胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)和改善治療效果的關(guān)鍵因素。

體外實驗顯示，將hAECs或hAMSCs與單核細胞共培養(yǎng)(細胞接觸或Transwell培養(yǎng))，均能改變單核細胞的分化方向，并使具有抗炎效應(yīng)的細胞因子分泌增加。并且，與Transwell培養(yǎng)相比，細胞接觸培養(yǎng)對單核細胞的影響更強[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，hAMSCs能通過抑制MAPKs和NF-κB信號通路，減少脂多糖(lipopolysacchride,LPS)刺激的巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β[30]。此外，hAMSCs還能抑制其向M1-巨噬細胞分化，促進其向M2型轉(zhuǎn)化[28]，從而減輕炎癥反應(yīng)。而且，單核細胞與hAMSCs共培養(yǎng)產(chǎn)生的巨噬細胞具有抑制T細胞增殖，使T細胞分泌的顆粒酶B減少的功能[31]。不僅如此，hAMSCs的條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)還能促使小鼠骨髓衍生的巨噬細胞向M2-巨噬細胞分化，表現(xiàn)為高表達抗炎因子IL-10和TGF-β1以及低分泌促炎因子IL-12、TNF-α、RANTES和NO[31]。

人羊膜細胞不僅能改變單核細胞分化，同時在體內(nèi)能抑制巨噬細胞向炎癥部位遷移。研究表明，hAECs能通過分泌免疫抑制因子誘導巨噬細胞凋亡[20]。并且，將hAECs、hAMSCs及其CM注射入LPS誘導的小鼠肺損傷模型體內(nèi)，能減少巨噬細胞向肺部浸潤，降低肺纖維化[32,33]，這與小鼠體內(nèi)促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、LIF和趨化因子MCP-1和MIP-2的分泌水平降低，以及抗炎細胞因子IL-10、TGF-β、PGE2的分泌水平升高有關(guān)。此外，在傷口愈合模型中，注射hAMSCs-CM能誘導M1向M2型轉(zhuǎn)換，增強M2-巨噬細胞的功能，促進組織修復(fù)再生[31]。

2.4人羊膜細胞對自然殺傷細胞的影響 人羊膜細胞對自然殺傷細胞(natural killer,NK)也有一定的影響。Li等[34]報道hAECs和hAMSCs呈劑量依賴模式抑制NK的殺傷能力。這與人羊膜細胞抑制NK受體(NKp30，NKp44，NKp46，NKG2D，CD69)活化有關(guān)。有趣的是，這種效應(yīng)是可逆的，因為在移除人羊膜細胞后連續(xù)培養(yǎng)能恢復(fù)NK細胞毒活性。人羊膜細胞抑制NK的細胞毒活性，與其旁分泌產(chǎn)生的PGE2和IL-10有一定關(guān)系[34]。在單核細胞向DC分化過程中，hAECs能增加單核細胞表面免疫抑制分子HLA-G的表達[27]，而HLA-G表達的增加可增強對NK細胞毒活性的抑制[35]。

2.5人羊膜細胞對T細胞的影響 T細胞具有高度特異性，根據(jù)表面標志物和功能特征，可分為不同亞群，各亞群對急慢性炎癥和自身免疫反應(yīng)起著不同的調(diào)控作用。其中Treg在免疫應(yīng)答的負調(diào)節(jié)及免疫耐受中發(fā)揮了重要作用。研究表明，人羊膜細胞能通過調(diào)節(jié)T細胞增殖/活化影響免疫反應(yīng)。

體外實驗顯示，將人羊膜細胞與T細胞共培養(yǎng)，能明顯降低T細胞增殖[36-39]。并且，隨著人羊膜細胞數(shù)量與T細胞比值增加，其對T細胞的增殖抑制效應(yīng)越強[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，人羊膜細胞不僅能影響T細胞的增殖，也能調(diào)節(jié)T細胞的成熟/活化。Pianta等[28]發(fā)現(xiàn)，將hAMSCs與T細胞共培養(yǎng)，能抑制T細胞增殖，同時使T細胞偏向Treg亞群活化。有趣的是，用IFN-γ處理hAMSCs后，能增強其對T細胞的抗增殖作用[38]，說明不同的微環(huán)境能影響人羊膜細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。近來，Laranjeira等[40]證明，對于不同的T細胞亞群(初始T細胞、效應(yīng)T細胞、效應(yīng)記憶性T細胞和中央型記憶T細胞)，人羊膜提取物均具有抗增殖作用，并能減少CD8+T細胞產(chǎn)生顆粒酶B、穿孔素、NKG2D等，增加表達IL-10和FoxP3的T細胞比率。另外，hAMSCs-CM能抑制T細胞向Th1和Th17亞群分化，下調(diào)Th1細胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-1β，以及Th17細胞因子IL-17和IL-22的表達[39]。就人羊膜細胞調(diào)節(jié)T細胞增殖及分化能力，可能與其自身旁分泌的IDO、PGE2、TGF-β、HGF等可溶性細胞因子有密切關(guān)系[11,12]。

在體內(nèi)，人羊膜細胞對T細胞的調(diào)節(jié)作用與體外保持一致。例如，在膠原誘導性關(guān)節(jié)炎[14]和實驗性自身免疫性葡萄膜炎[37]模型中，人羊膜細胞能選擇性下調(diào)體內(nèi)Th1和Th17亞群比例，增加Treg亞群比例，恢復(fù)Th1/Th2和Th17/Treg比值，從而降低疾病的發(fā)生率和嚴重程度。

這些研究證明，人羊膜細胞能夠以T細胞為靶標，抑制自身損傷性炎癥反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)的作用。這表明人羊膜細胞在治療移植物抗宿主病、自身免疫性疾病等方面具有先天優(yōu)勢。

3 結(jié)語與展望

損傷后激活的免疫反應(yīng)是把雙刃劍，異常的免疫應(yīng)答可導致多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生，合理抑制損傷部位的免疫反應(yīng)，對組織再生與修復(fù)至關(guān)重要。體外和臨床前動物模型的研究表明，人羊膜細胞具有強烈抑制先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的特性，并在炎癥發(fā)展的不同階段均能抑制免疫細胞活性，誘導外周免疫耐受，逆轉(zhuǎn)炎性損傷。因此，人羊膜細胞在炎癥性疾病、移植物抗宿主病等疾病的治療方面表現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。但是，目前的研究尚未完成臨床試驗，并且，有研究表明人羊膜細胞在體內(nèi)外均具有一定的免疫刺激作用[41,42]。因此，進一步了解人羊膜細胞的作用機制，特別是它們?nèi)绾闻c微環(huán)境相互作用，以及如何重建機體免疫平衡是實現(xiàn)人羊膜細胞廣泛應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。