中藥單體成分調(diào)控自噬治療膿毒癥研究進(jìn)展?

李國臣 孔 立 王為為 田正云 郝 浩 張飛虎

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011）

膿毒癥由嚴(yán)重的感染，創(chuàng)傷或內(nèi)毒素引發(fā)的人體對感染反應(yīng)失衡而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，近年來盡管在藥物治療和器官支持方面取得了巨大進(jìn)步，并且對膿毒癥的病理生理學(xué)有了更多的了解，但它仍然是ICU患者死亡的主要原因[2-3]。國內(nèi)一項(xiàng)回顧性研究顯示，我國標(biāo)準(zhǔn)化膿毒癥相關(guān)死亡率66.7/10萬，年齡每增加5歲，死亡風(fēng)險(xiǎn)升高1.914倍[4]，膿毒癥已成為醫(yī)療、社會(huì)沉重負(fù)擔(dān)。因此，迫切需要了解膿毒癥發(fā)病機(jī)理的新機(jī)制并尋找新的治療策略。

自噬是指細(xì)胞通過生物膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)形成自噬體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器更新的一種自我吞噬循環(huán)過程[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，它參與了免疫細(xì)胞殺滅病原體或處理、呈遞抗原的整個(gè)過程，這些都突顯了其作為感染性疾病（包括膿毒癥）的治療靶標(biāo)的潛力[6-7]。多項(xiàng)研究表明自噬與膿毒癥之間關(guān)系密切，貫穿膿毒癥的始終。近年來中醫(yī)藥研究方興未艾，越來越多的研究證實(shí)中藥單體成分在調(diào)控自噬防治膿毒癥方面具有一定作用。本文主要從自噬、膿毒癥與自噬及中藥相關(guān)成分3個(gè)方面對近年來研究做一綜述。

1 自 噬

自噬可簡單解讀為“細(xì)胞的自我消化”，細(xì)胞可通過自噬降解胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，降解后產(chǎn)生的氨基酸、核苷酸和小分子物質(zhì)等被細(xì)胞再次利用，為胞內(nèi)新細(xì)胞器的構(gòu)建提供原料，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)原料物質(zhì)的再循環(huán)[5]。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔方式的不同，細(xì)胞自噬可分為3種主要類型：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。其中巨自噬是最普遍的一種，即通常所說的自噬。細(xì)胞自噬的發(fā)生過程主要包括4個(gè)階段，即底物誘導(dǎo)自噬前體的形成、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體內(nèi)容物被降解。在即將發(fā)生自噬的細(xì)胞胞質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)許多游離雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為自噬前體。自噬前體進(jìn)一步被誘導(dǎo)形成杯狀凹陷，包裹細(xì)胞質(zhì)中損傷或衰老的細(xì)胞器（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等），形成自噬體，然后與溶酶體融合成自噬溶酶體。在自噬溶酶體中，其內(nèi)容物被重新降解成各種底物和小分子物質(zhì)，供細(xì)胞再次利用。自噬主要受自噬相關(guān)基因（Atgs）調(diào)節(jié)，目前已知的已有30多種[8-9]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）和Beclin-1均是重要的自噬體標(biāo)志性蛋白，當(dāng)自噬啟動(dòng)后，胞質(zhì)型LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)位到自噬體膜LC3-Ⅱ是自噬體形成的標(biāo)志，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平、Beclin-1表達(dá)可反映自噬水平[5]。目前發(fā)現(xiàn)的自噬通路主要包括依賴?yán)着撩顾匕械鞍祝╩TOR）的自噬和不依賴mTOR的自噬[10]。

2 膿毒癥與自噬

自噬一般被認(rèn)為是細(xì)胞的自救行為，當(dāng)生物體受到各種應(yīng)激時(shí)，自噬可執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序以及激活固有的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，能夠協(xié)助生物體對抗多種疾病。近年來的研究表明，膿毒癥的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，與炎癥風(fēng)暴、氧化應(yīng)激、凝血異常、缺血-再灌注損傷及機(jī)體多部位屏障功能破壞引發(fā)二次感染等多種因素相關(guān)[11]。多項(xiàng)研究表明自噬與膿毒癥之間聯(lián)系密切，基礎(chǔ)研究已證實(shí)自噬在膿毒癥患者和盲腸結(jié)扎和穿刺（CLP）動(dòng)物模型中均被激活[12]。此外，一項(xiàng)多中心前瞻性隊(duì)列研究表明，IRGM（免疫相關(guān)GTPase家族，M）基因中自噬相關(guān)基因的多態(tài)性與膿毒癥的過度死亡率相關(guān)[13]。自噬作為細(xì)胞的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，貫穿于膿毒癥始終。

2.1 膿毒癥誘導(dǎo)自噬機(jī)制 膿毒癥時(shí)自噬主要是通過微生物結(jié)構(gòu)中病原體相關(guān)分子模式與模式識(shí)別受體（如toll樣受體）的結(jié)合被誘導(dǎo)，進(jìn)一步激活不同的細(xì)胞內(nèi)事件，并通過促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化而增強(qiáng)自噬活性。主要有以下兩個(gè)通路[14-15]。1）TLR4（toll樣受體4）：膿毒癥時(shí)革蘭氏陰性病原體的脂多糖與TLR4的結(jié)合被激活。通過MAPK/p38（促分裂原激活的蛋白激酶）信號(hào)軸促進(jìn)自噬，而脂磷壁酸與TLR2的結(jié)合則通過MAPK1/ERK2-MAPK3/ERK1途徑誘導(dǎo)自噬。2）線粒體自噬：膿毒癥時(shí)嚴(yán)重感染會(huì)觸發(fā)促炎性細(xì)胞因子的釋放及活性氧的產(chǎn)生，這些活性氧會(huì)增加氧化應(yīng)激和線粒體損傷。這通常表現(xiàn)為線粒體膜電位喪失和CYCS（細(xì)胞色素c，體細(xì)胞）釋放到胞質(zhì)溶膠中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增加會(huì)上調(diào)HSPA5/GRP78蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的跨膜蛋白EIF2AK3/PERK和EIF2S1磷酸化。損壞的線粒體募集蛋白，例如PARK2，BNIP3L和BNIP3，會(huì)對靶向細(xì)胞器進(jìn)行線粒體吞噬。線粒體自噬在隔離這些失活的細(xì)胞器中起著重要作用，可防止進(jìn)一步加劇促炎反應(yīng)并最小化對宿主的氧化損傷。

2.2 膿毒癥中自噬的動(dòng)力學(xué)和差異性 膿毒癥病理機(jī)制復(fù)雜，初期為失控的全身炎癥反應(yīng)，后期多為機(jī)體免疫抑制，因而膿毒癥時(shí)自噬的活性不是一成不變的，同時(shí)不同組織器官自噬活性也存在差異性[15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在CLP造模后的最初4～6 h內(nèi)，自噬體數(shù)量增加，自噬活性升高，而8 h后自噬溶酶體（自噬體與溶酶體融合的產(chǎn)物）的數(shù)目開始減少，說明自噬活性降低[16]。在最初時(shí)，肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞率先顯示出較高的LC3-Ⅱ∶LC3-Ⅰ比（自噬誘導(dǎo)的標(biāo)志），另一項(xiàng)研究也觀察到了相同的自噬變化[17]。這表明膿毒癥時(shí)，初期自噬在短暫的過度活躍后，后期自噬會(huì)受到抑制。同時(shí)，肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞顯示出更高的自噬誘導(dǎo)水平可能是對敗血癥誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)的主要細(xì)胞類型。進(jìn)一步明確膿毒癥時(shí)自噬動(dòng)力學(xué)和差異性，有利于尋找膿毒癥新的治療策略。

3 中藥單體成分調(diào)控自噬治療膿毒癥的研究進(jìn)展

較多研究已證實(shí)自噬在膿毒癥進(jìn)展與器官功能障礙的形成中具有一定保護(hù)作用，是一個(gè)值得研究的治療靶點(diǎn)，但目前尚沒有可以應(yīng)用于臨床的自噬特異性調(diào)控藥物。近年來，中醫(yī)藥在膿毒癥的救治方面起到越來越重要的作用，與西醫(yī)的作用靶點(diǎn)及機(jī)理較為單一相比，中醫(yī)藥的優(yōu)勢在于可以從整體出發(fā)對膿毒癥進(jìn)行辨證施治。自噬作為膿毒癥發(fā)展過程中重要的保護(hù)機(jī)制，已備受中醫(yī)藥研究者關(guān)注并深入挖掘，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些中藥的單體成分可通過調(diào)節(jié)自噬來抑制膿毒癥時(shí)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和器官功能保護(hù)。

3.1 炎癥反應(yīng) 機(jī)體失控性炎癥反應(yīng)學(xué)說被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)病機(jī)制的重要基礎(chǔ)[11]。膿毒癥患者大都存在一定程度的免疫功能受損，從而喪失了感染早期對促炎和抗炎反應(yīng)的調(diào)控，促炎與抗炎作用的失衡將會(huì)啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起SIRS。自噬在負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，自噬通路與炎癥反應(yīng)存在多個(gè)交叉，二者之間聯(lián)系密切[18-19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥單體成分在調(diào)控自噬抑制膿毒癥炎癥反應(yīng)方面具有一定的作用。研究表明[20]，青藤堿能減輕CLP小鼠的炎癥反應(yīng)，并能抑制LPS引起的巨噬細(xì)胞炎癥。彭玥等繼而通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)[21]，青藤堿能減輕LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥，且其對炎癥的調(diào)控作用與HO-1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬激活相關(guān)。Mei等研究發(fā)現(xiàn)[22]，青蒿虎酯能夠抑制LPS誘導(dǎo)的raw264.7細(xì)胞、小鼠骨髓源性單核細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6。使用自噬抑制劑3-MA、bafilomycin A1或靶向ATG5基因的siRNA抑制自噬時(shí)，青蒿虎酯對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放的抑制作用被減弱。進(jìn)一步證明，青蒿琥酯在一定程度上通過激活自噬，抑制巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子，從而減輕過度的炎癥反應(yīng)及后續(xù)的器官損傷。

3.2 器官保護(hù) 自噬在膿毒癥狀態(tài)下對重要臟器功能的保護(hù)作用已較為明確，相關(guān)基礎(chǔ)研究相繼在膿毒癥模型動(dòng)物的肝、肺、心、腦等重要臟器中發(fā)現(xiàn)自噬體及相關(guān)蛋白表達(dá)增高[23]，并證實(shí)與膿毒癥發(fā)展過程密切相關(guān)。膿毒癥時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可以減輕器官功能損傷起到保護(hù)作用，抑制自噬會(huì)加重重要臟器功能障礙，對膿毒癥預(yù)后產(chǎn)生不良影響。近年來多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)，中藥單體成分在調(diào)控自噬保護(hù)膿毒癥臟器功能方面具有重要作用。1）肺保護(hù)。研究表明[24]，人參的有效成分人參皂苷Rg1可通過提高自噬水平抑制LPS引起的小鼠肺上皮細(xì)胞的凋亡，減輕肺間炎癥浸潤，肺損傷程度明顯減輕。此外，大蒜素可保護(hù)膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷，其保護(hù)膿毒癥肺損傷的機(jī)制除了與大蒜素的抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)外，還與其調(diào)控自噬有關(guān)[25]。CLP動(dòng)物模型中，大蒜素治療可使實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)增高，表明大蒜素可通過上調(diào)小鼠肺組織自噬水平，有效減輕膿毒癥肺損傷。2）心臟保護(hù)。丹酚酸B是中藥丹參中含量最豐富的水溶性物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B能上調(diào)膿毒癥大鼠心肌組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin-1表達(dá)，增強(qiáng)自噬反應(yīng)，降低膿毒癥大鼠心肌炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕膿毒癥大鼠心肌的損傷[26]。Li等的研究表明[27]，芹菜素通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、MIP-1α和MIP-2）的表達(dá)及其主要調(diào)節(jié)因子NF-κB，能夠減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌損傷，并證實(shí)其抗炎作用可能與調(diào)控自噬有關(guān)。芹菜素可能通過調(diào)節(jié)ATG5、P62基因誘導(dǎo)自噬，控制膿毒癥早期失控的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低膿毒癥器官損傷。3）腦保護(hù)。川芎嗪是中藥川芎的有效成分，朱浩等的研究顯示[28]：川芎嗪能夠減輕大鼠膿毒癥相關(guān)性腦病，其機(jī)制與抑制海馬神經(jīng)元自噬有關(guān)。CLP制備膿毒癥大鼠模型，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估腦病程度，研究結(jié)果顯示，大鼠腹腔注射川芎嗪后較對照組海馬LCⅡ/Ⅰ比值升高，Beclin-1表達(dá)上調(diào)，P62表達(dá)下調(diào)，表明自噬水平上升。4）肝保護(hù)。梔子苷又名京平尼苷，是中藥梔子的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)梔子苷可降低CLP小鼠血清中的氨基轉(zhuǎn)移酶和促炎細(xì)胞因子水平，保護(hù)肝功能。通過對其作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，梔子苷能上調(diào)自噬相關(guān)蛋白（Atg）12-Atg5偶聯(lián)物和Atg3蛋白在肝臟的表達(dá)，減緩了溶酶體相關(guān)膜蛋白2和Rab7蛋白的表達(dá)下降，并增加了CLP誘導(dǎo)的鈣蛋白酶1蛋白在肝臟中的表達(dá)，恢復(fù)自噬通量[29]。通過反證法證實(shí)梔子苷的這一效果能被自噬抑制劑氯喹抑制，進(jìn)一步證實(shí)，梔子苷可通過恢復(fù)受損的自噬通量來預(yù)防膿毒癥肝損傷，可能是膿毒癥的潛在治療劑。人參皂苷是中藥人參中的一種固醇類化合物。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3處理LPS誘導(dǎo)的人原代肝細(xì)胞可觀察到更低的ROS值和更高的MTP值，并能維持GSH池及其結(jié)合活性。通過對其作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，這一作用與其激活A(yù)MPK信號(hào)通路上調(diào)自噬相關(guān)蛋白，抑制線粒體功能障礙，保護(hù)肝細(xì)胞線粒體功能障礙有關(guān)[30]。人參皂苷Rg3的保護(hù)作用可被自噬抑制劑或AMPK抑制劑減弱，也反向驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

4 結(jié) 語

近年來，膿毒癥的總體診療水平明顯進(jìn)步，重癥監(jiān)護(hù)病房支持治療水平也大幅提高，但膿毒癥死亡率仍未見明顯降低。自噬作為新認(rèn)識(shí)到的重要的細(xì)胞學(xué)事件，與膿毒癥的關(guān)系密切，值得深入探索及尋找與其相關(guān)的膿毒癥治療靶點(diǎn)。目前許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，中藥單體成分可以通過調(diào)控自噬來防治膿毒癥，如青藤堿、青蒿琥酯可通過調(diào)控自噬來減輕膿毒癥時(shí)失控的炎癥反應(yīng)；川芎嗪、梔子苷、人參皂苷等可激活自噬，發(fā)揮膿毒癥時(shí)重要器官保護(hù)的作用。中醫(yī)藥是中醫(yī)學(xué)的偉大寶庫，如何更好地運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)深入挖掘其在治療膿毒癥中的重要靶點(diǎn)和優(yōu)勢作用，為膿毒癥的治療尋找更為有效的干預(yù)方法，仍是需要中醫(yī)藥研究者們繼續(xù)探索的問題。