膽堿能神經病理損傷阿爾茨海默病模型構建

李偉 (宜春學院體育學院，江西 宜春 336000)

阿爾茨海默病(AD)作為臨床上最常見的老年神經病變性疾病，是一種以記憶力減退、判斷能力和理解能力下降等為主要臨床表現的退行性神經疾病。隨增齡，其發病率逐年升高。AD病程緩慢且難以逆轉，早期多見記憶力和思維能力的明顯減退，隨后表現為辨認能力缺失，如辨別方向障礙等，語言表達困難、生活自理能力喪失等病理特征，終會因感染等嚴重并發癥導致死亡。其病理特征的改變常與大腦海馬和皮層神經元喪失，胞內出現神經纖維纏結，胞外出現沉淀的老年斑等相關〔1〕。為更進一步探究和驗證AD的發病機制，眾多學者依據其發病的病理機制，構建了多種動物模型，如篩選帶有認知和記憶嚴重缺失的個體為代表的衰老認知障礙動物和自然發病的老化癡呆鼠模型、實施轉基因技術構建轉基因AD動物模型、外因造成腦供血不足致腦損傷誘導的老年動物慢性腦缺血模型、依靠改變外界因素致長期慢性缺氧狀態的AD模型，通過腦內注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)造模的AD動物模型及采用鵝膏蕈氨酸(IBO)致基底前腦神經元毒性損傷造AD模型、長期進行岡田軟海綿酸(OA)腦室投遞誘導動物記憶嚴重缺失，導致腦內Aβ淀粉樣沉積斑塊的AD模型、乙酰膽堿M受體阻斷致癡呆動物模型、鋁元素中毒AD模型等。其中以膽堿能神經損傷的病理改變機制進行的AD造模是當前研究的重要領域之一。乙酰膽堿(ACh)作為最早發現的神經遞質，能合成乙酰膽堿并以ACh為神經遞質的神經元稱為膽堿能神經元，膽堿能神經元在中樞神經系統內的分布極為廣泛，其在AD的病理機制研究中占據著極為重要的地位，扮演重要的角色〔2〕。作為慢性神經退行性病變的AD，其重要的病理特征之一就是膽堿能神經元的丟失，從相關研究結果來看，雖然在AD早期膽堿能神經元并未丟失，而是收縮丟掉其表型標記物或處于萎縮狀態〔3,4〕。

1 AD模型病理特征及其模擬方法

1.1AD的膽堿能神經病理改變 AD的常見病理改變包括細胞外聚集的Aβ沉積形成老年斑塊、細胞內高度磷酸化Tau蛋白所致的神經纖維纏結及前腦基底膽堿能神經元的顯著丟失等，且三者之間有著密切的相互關系，比如AD患者腦內的Aβ可損害膽堿能神經元，引起ACh系統的病變〔5〕，而Aβ比例失衡，在腦內沉積形成老年斑，可激活小膠質細胞，引發炎癥反應，損害線粒體誘發能量代謝障礙，氧自由基生成增多，誘發氧化應激損害，激活細胞凋亡途徑，介導細胞凋亡，還能通過激活蛋白激酶，促進Tau蛋白異常磷酸化〔6〕。這些病理改變又會反作用促進Aβ生成增多導致異常沉積，進一步促使正反饋的級聯放大效應，誘導神經元減少，5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺等的遞質異常。

1.2Aβ注射模擬大鼠AD模型病理特征 Aβ是由40～42個氨基酸構成的多肽蛋白，是淀粉樣前體蛋白(APP)的水解產物，疏水性強且易聚集。Aβ在腦組織內的異常代謝會致使腦組織細胞RNA、DNA及蛋白質、脂質的過氧化反應過程〔7〕，損害線粒體的功能〔8〕、增強氧化應激反應，促進Tau蛋白過度磷酸化，誘導神經元的凋亡；Aβ的異常沉積還能形成免疫原應激反應，激活非特異性的免疫反應介導神經元損傷，進而觸發Aβ級聯反應，誘發一系列的神經功能損害。因此，Aβ沉積與神經元損傷、認知障礙、記憶喪失等的程度高度相關，Markesbery〔9〕已經證實Aβ是誘發腦部神經細胞氧化應激及細胞凋亡的重要原因之一。研究證實，Aβ在腦組織的異常代謝和沉積是AD發病的重要環節〔10,11〕。在AD患者機體中有較強的神經毒性的游離Aβ單體或寡聚體，游離的Aβ單體主要通過損傷突觸的離子通道影響突觸的可塑性、葡萄糖載體參與能量代謝，誘導氧化應激損傷、擾亂Ca2+平衡等途徑導致神經元的毒性變化，相比Aβ單體而言，聚集早期的寡聚體毒性最強〔12,13〕。老年斑是AD的又一重要的病理學改變，而Aβ是老年斑的主要成分。體外實驗結果表明Aβ在較低濃度時便可產生神經毒性作用，腦內注射微量Aβ可誘導動物產生記憶缺損等行為學障礙，出現典型性病理特征的Aβ沉積，與AD的病理改變極為相似的。因此，采用海馬內單點注射或多點注射是一種較好的AD動物模型〔14,15〕。

主要的研究以Alvarez等〔16〕、Nabeshima〔17〕分別用單側或雙側海馬注射Aβ28片段，或者內置微型滲透壓泵進行大鼠腦室灌注Aβ，再經被動回避、水迷宮等行為學評定證實大鼠認知功能受損程度，結合海馬與大腦前端皮層膽堿乙酰化酶活性的變化評價產生的持續性損害。研究發現Aβ注射后4 w內海馬APP的表達顯著增加，同時伴隨有較為嚴重的認知功能損害，依此可證實Aβ過度沉積于AD的發病存在密切相關關系〔18〕。可見，Aβ注射可構建急性AD損傷模型，隨之動物出現與AD患者相似的記憶功能障礙，病理檢測有明顯的Aβ沉積，可較好地復制了AD病理特征〔19〕。此方法能快速建模，學習記憶障礙顯著，損害部位明確，病理學檢查可見明顯的海馬腦區錐體細胞丟失〔20,21〕。但該模型存在的不足也很明顯，比如在注射Aβ時，稍不注意，就會造成海馬區域周圍腦組織的局灶性穿透損傷，導致注射點周圍聚集大量的Aβ難以彌散地分布至腦內，易引起局部Aβ沉積過度，誘發局灶性腦細胞損傷。同時，被造模動物自身也有Aβ的清除功能，雖然該模型病理表現有典型的Aβ沉積，但持續時間不長，難以體現神經纖維纏結等的病理改變。

1.3Tau蛋白磷酸化模型構建AD病理特征 正常情況下，在催化磷酸化反應的蛋白激酶和催化去磷酸化反應的蛋白磷酸酯酶的共同調節作用下Tau蛋白處于動態平衡。Tian等〔22〕對SD大鼠雙側基底核注射蛋白磷酸酯酶-2A的抑制劑OA，可誘導Tau蛋白的過度磷酸化，致使Meynert基底核呈現Tau蛋白ser199/202位點的高度磷酸化，使其空間記憶力顯著下降，并伴隨有非磷酸化蛋白的表達降低。Yin等〔23〕采用相同方法發現，非磷酸化Tau蛋白減少，大鼠的記憶力明顯下降，Tau蛋白ser214、ser262、ser396等過度磷酸化。類似的研究還有Nelson等〔24〕把OA注射入大腦皮質，使其誘導產生扭曲的營養不良性神經突；Lee等〔25〕將OA注入大鼠海馬背側，發現雙螺旋細絲與營養不良性神經氈模出現，APP免疫反應明顯，微管蛋白-2降低；后又有學者注射OA于大鼠額葉皮質后，發現細胞周期蛋白B1的表達增強，Tau蛋白磷酸化增加，神經元有絲分裂樣潰變嚴重〔26〕。Rosenmann等〔27〕采用神經性Tau蛋白免疫小鼠，誘導AD模型鼠組織病理學改變特征，復制出典型的神經纖維纏結和軸突的損害。但由于采取注射藥物誘導Tau蛋白過度磷酸化的過程，因此只能體現Tau蛋白的病理表現，該模型多應用于Tau蛋白磷酸化機制研究或抗Tau蛋白磷酸化作為靶標研發新藥物的應用研究，因此，該模型的局限性較為明顯。

2 膽堿能神經損傷模擬AD病理損傷

伴隨著近年來化學神經解剖學、認知神經科學和分子生物病理學等的發展，中樞膽堿能神經系統損傷在AD認知障礙中的作用日益受到重視。近年來的研究現已經證實AD患者腦組織和腦脊液中Ach酯酶和Ach轉移酶的攝取、合成與釋放功能的下降，影響患者記憶力，出現典型的認知功能障礙。因此，膽堿能系統的活性與人的學習記憶與認知活動過程密切相關。重癥AD患者尸檢結果也證實，患者基底前腦的膽堿能神經元丟失，致使AD的合成、儲存與釋放功能下降，導致其記憶與認知功能障礙〔28〕。也有學者早期發現，AD患者腦中老年斑和神經纖維纏結部位增加了以不對稱結構存在的Ach受體(AchE)，其膠原樣的尾部，進一步促進Aβ沉積，形成老年斑〔29〕。有學者提出AD發病的膽堿能學說，該模型的構建主要是依靠膽堿能學說為基礎，以引起包括大腦新皮層、海馬、中縫背核與基底核等在內的腦功能部位率先出現膽堿能神經元退變、膽堿能神經功能降低，誘發AD病理改變。

3 膽堿能神經損傷構建AD模型

3.1物理手段切斷海馬傘致膽堿能神經損傷進行AD造模 采用此手段進行AD造模是建立在AD認知功能障礙的膽堿能學說基礎上，采用手術法切斷大鼠海馬傘致穹隆-海馬傘斷裂，引起動物空間定向和記憶障礙的同時，誘發膽堿能損傷模型〔30〕，造成大腦中樞神經元損傷。該模型可用于觀察以膽堿能藥物的藥效學評價，或觀察和開發新藥物對神經功能損傷的修復作用，常可用于AD臨床前藥效學研究的重要模型。龍大宏等〔31〕通過免疫電鏡和形態計量學分析和評價損傷左側穹隆海馬傘造成隔-海馬膽堿能系統損害的老年鼠AD模型，損傷后1個月檢測發現損傷側齒狀回分子層神經生長因子受體陽性突觸前終末、突觸后致密物和ACh轉移酶陽性軸突終末面積和周長都有不同程度的縮小。按照相似原理，Miyamoto等〔32〕也通過電解損傷Meynert基底核(NBM)降低大腦皮質ACh含量，增加記憶障礙，降低認知功能。這類造模方法主要在20世紀的七八十年代比較常見，主要采取手術方法切斷扣帶束、海馬傘、背穹隆等海馬通路，損壞膽堿能神經纖維的傳導功能，影響海馬定向，增加其記憶障礙。該模型的優點表現在造模周期短，不足主要體現在腦組織中單胺氧化酶B活性未見顯著升高，且手術定位困難，難以避免損傷鄰近組織，因此，采用此方法進行造模的方式已被淘汰。

3.2化學藥物致膽堿能損傷進行AD造模 采用化學藥物方法復制AD膽堿能損傷的常見方法包括腹腔注射東莨菪堿及樟柳堿(膽堿能拮抗劑)、1-乙基-1(2-羥乙基)氯化氮丙啶及海人藻酸(KA)、鵝膏蕈氨酸、使君子酸(QUIS)、N-甲基-D-天冬氨酸等神經毒素，損害膽堿能神經元功能的同時，也影響非膽堿能神經元的功能。在這些致神經損傷的藥物中，以IBO為首選，IBO能恒定地損害動物學習記憶有關的行為執行。相比于IBO和QUIS對基底前腦的損害來看，基底前腦細胞對KA的敏感性低，用量大，稍有不慎便會引起動物的不正常死亡，而且在導致基底前腦細胞損害的同時，也引起包括海馬錐體細胞在內的其他部位的神經元死亡〔33,34〕。

3.2.1乙酰膽堿M受體阻斷劑致AD動物模型 東莨菪堿作為膽堿能拮抗劑，能有效阻斷大腦皮質中的Ach受體的結合位點，而Ach是神經系統重要的化學遞質，在神經信號傳導過程中起到重要的信使作用，由于其結合位點被阻斷進而誘發膽堿能系統的功能障礙。付君〔35〕參考Ahmed等〔36〕、Kotani等〔37〕的方法采取腹腔注射氫溴酸東莨菪堿〔1.5 mg/(kg·d)，連續7 d〕的方法進行AD建模。第7天水迷宮試驗后檢測血液和腦組織發現AchE含量明顯增高，膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)含量明顯降低，說明造模效果明顯。葉翠飛等〔38〕于每天試驗前0.5 h對實驗組動物進行腹腔注射給藥東莨菪堿制劑，腦組織測試結果顯示M受體結合力明顯下降。有研究指出，東莨菪堿或樟柳堿急性注射模型難以出現AD的組織病理學改變，而AD作為一種進行性不可逆的神經系統疾病，采用此模型造模的突觸后AchM受體未見明顯減少。因此，此模型主要以造成受試認知功能障礙，對長時記憶功能及海馬神經元結構無明顯影響〔39〕，從病理上來看，尚缺乏AD特殊病理特征，且阻斷是可逆的。

3.2.2IBO致AD大鼠模型 具有強烈神經興奮毒性作用的IBO是一種谷氨酸受體激動劑，常與神經元樹突或胞體上的N-甲基-D-天冬氨酸受體結合誘發神經元潰變性中毒損傷〔40〕。采用此方法造模時，常在大鼠腦立體定位后〔41〕，采用常規消毒大鼠頭部皮膚后，在頭部中線處，縱向1.0～2.0 cm切口。用10%過氧化氫擦拭，暴露大鼠前囟點，再用微量進樣器的針頭對準前囟，抽取1 μl IBO，待拔出三棱針后，將標尺移回到原定位點，繼續向硬膜下移動8.2 mm。10 min內單側勻速注射IBO 5 μg，留針5 min出針，對側相同位置采用同樣方法注射IBO5 μg。雙側注射藥物后，取下大鼠，縫合大鼠頭皮，酒精常規消毒。霍江濤等〔42,43〕選擇4月齡的SD雄性小鼠，采用NBM位置注射KA構建AD實驗模型。具體如下：首先采用1%的巴比妥鈉(20 mg/kg體重)進行腹腔注射，用以麻醉，然后用腦立體定位儀將其固定，再在顱骨線處將皮膚剪開，確定NBM的位置后，在顱骨上鉆出約1.0 mm的孔徑，再在NBM的兩側用微量注射器注入1 μl的KA，為破壞該區域的膽堿能細胞，需要勻速緩慢注射，注射后并留針5 min，術后及時進行處理，不僅要縫合皮膚，且為避免感染，需要按時給予青霉素注射消炎，連續進行3 d。Ahmed等〔44〕將IBO微量注射入大鼠NBM后，發現該方法一方面造成大鼠被動逃避反應潛伏期縮短，另一方面組織學檢查可見腹側丘腦和小丘腦外側區損毀，蒼白球腹內側核膽堿能神經元大部分消失，膠質細胞增生等病理癥狀。該造模方法屬于興奮性毒素致基底核損害模型，通過IBO注射常可導致反應學習記憶功能下降、基底前腦膽堿能神經元缺失等的病理學改變，雖然該類模型的缺陷是難以誘導產生AD的病理學特征，不能誘導出AD的病因，但廣泛應用于膽堿能神經元損傷藥物的篩選與藥效研究。侯雪芹等〔45〕對比了氫溴酸東莨菪堿致記憶障礙模型、鵝膏蕈酸致癡呆大鼠模型、快速老化模型及雙轉基因小鼠模型進行對比，結果顯示快速老化小鼠的Morris水迷宮測試、Bcl-2蛋白表達及凋亡檢測較其他模型組更為明顯，提示快速老化模型對于老年癡呆凋亡機制的研究優勢明顯，可為臨床研究防治老年癡呆的新藥開發提供指導。

3.2.3OA慢性損害進行AD造模 OA可特異性抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化酶，激活蛋白激酶(PK)C，一旦絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化酶受到抑制便可引起Tau蛋白過磷酸化，誘發神經纖維纏結的形成，引起慢性損害，誘導AD病理損傷，此方法可用于AD造模。因此，作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化酶特異性抑制劑，長期進行腦室投遞，可引起動物記憶缺失，腦內出現神經纖維纏結樣磷酸化Tau蛋白和Aβ沉積斑塊。Arendt等〔46〕發現絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸化酶的活性抑制、PKC激活均可刺激Aβ的生成，進而引起Aβ的沉積和神經纖維纏結的形成。正是由于OA的這一作用，可同時復制AD典型的病理改變神經纖維纏結和老年斑的形成，因此該模型具有明顯的優勢，比如通過該模型從Aβ和Tau蛋白代謝異常及二者相互作用誘導AD發病探究其病理機制。該模型的研究主要傾向于認知缺失與前腦膽堿能系統損傷模擬AD病理改變〔47〕。

3.2.4自身免疫抗膽堿能神經元損傷AD模型 成威〔48〕的研究結果顯示AD患者血清與腦脊液中含有抗膽堿能神經元抗體，患者腦內存在炎癥免疫反應，并在老年斑中發現了多種補體成分，可見該AD患者所患疾病為自身免疫性疾病。羅秀梅等〔49〕建立了大鼠側腦室注射免疫毒素192-IgG-Saporin AD模型，Y迷宮檢測和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶(NADPH-d)組織化學法染色分析結果顯示，造模后的大鼠學習、記憶能力明顯損害，基底前腦內側隔核和斜角帶垂直支一氧化氮合酶(NOS)陽性神經元數明顯減少，基底前腦的膽堿能細胞選擇性地嚴重破壞，細胞周長和面積降低，灰度值升高等典型癥狀，進一步證實自身膽堿能神經元抗體誘導膽堿能神經元損傷的可能。

3.2.5其他化學方法致膽堿能神經損傷造AD模型 除了以上常用化學毒性藥物進行膽堿能損傷造模以外，還有學者采用乙基膽堿氮芥丙啶(AF64A)、白喉毒素、免疫毒素192-IgG-Saporin等進行損害大腦膽堿能神經元進行AD造模。如Fisher等〔50〕發現AF64A可誘導大鼠大腦皮層與海馬組織的膽堿能神經持續性損害，于是直接將AF64A注射入大鼠背側海馬，發現該方法引起的損傷與認知功能長期損害呈相同改變；也有研究在小腦室內注射AF64A，結果發現大腦皮層與海馬組織內的高親和力膽堿轉運(HAChT)呈非競爭性最大速率的下降，而紋狀體不受此干擾。Kudo等〔51〕也選擇將白喉毒素與神經生長因子結合形成白喉-神經生長因子結合毒素，通過神經生長因子受體介導的入胞作用，輸注入大鼠大腦皮質，避開非膽堿能神經元及周圍神經纖維選擇性損傷前腦基底核的膽堿能神經元。

綜上，AD發病率呈逐年遞增，且年輕化趨勢明顯，因此，針對AD發病機制的研究探索刻不容緩。ACh在調節突觸的可塑性方面起關鍵作用，可參與調節海馬及皮層的神經元活動，因此，針對膽堿能神經損傷類方法進行AD造模是一種病理模仿過程，在AD研究中占據重要的地位。但由于這類損傷膽堿能神經元AD模型，重點在于復制AD膽堿能功能減退和認知功能障礙、記憶功能損害為主要特征的病理性改變，但難以出現AD的典型性病理特征老年斑和神經纖維纏結。因此，該類造模方法常可用于評價藥物對AD樣膽堿能神經系統損害及其學習記憶與認知功能障礙的改善作用。