miR-29a通過調控DNMT3b對宮頸癌細胞周期、凋亡及P16甲基化的影響

白志興 (青海紅十字醫院婦產科，青海 西寧 810000)

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率居生殖系統腫瘤首位，且近年來發病呈年輕化趨勢〔1〕。目前對于宮頸癌的治療手段主要為根治性手術和放化療，治療過程中的不良反應嚴重影響患者的生活質量〔2〕。因此，研究宮頸癌發生的分子機制對于尋找治療宮頸癌的基因靶點十分重要。研究發現，癌基因區啟動子異常甲基化與腫瘤的發生、發展密切相關〔3〕。微小RNA(miR)可通過與靶基因3′-UTR區結合參與機體細胞增殖、凋亡等生理過程〔4〕。研究表明，miR-29a在非小細胞肺癌〔5〕、宮頸癌〔6〕等惡性腫瘤組織中異常表達，在前列腺癌疾病中可調控去甲基化基因表達發揮抑癌作用〔7〕。通過在線軟件預測發現，DNA甲基轉移酶(DNMT)3b是miR-29a的靶基因。本研究通過檢測宮頸癌組織中miR-29a表達，并分析其對宮頸癌細胞周期、凋亡及P16甲基化的影響，為宮頸癌防治尋求有效的干預靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1材料 細胞、HcerEpic人正常子宮頸上皮細胞，Hela、SiHa、MS751人宮頸癌細胞系均購自美國典型培養物保藏中心。主要試劑與儀器： miR-29a mimics及陰性對照mimics-NC購自上海生工生物工程股份有限公司； miR-29a 與內參基因U6基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；葡萄糖、胎牛血清、二甲基亞砜、DMEM培養基均購自美國ThermoFisher公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、MTS細胞生長增殖檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自美國sigma公司；蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購自上海碧云天公司；LipofectamineTM3000脂質體轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Anti-DNMT3b、Anti-GAPDH均購自上海鈺博生物科技有限公司。 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；CO2培養箱購自日本sanyo公司；酶標儀購自Bio-Rad公司；普通光學顯微鏡，購自美國Olympus 公司。

1.2細胞培養和轉染 細胞培養：將復蘇后的HcerEpic人正常子宮頸上皮細胞、Hela、SiHa、MS751人宮頸癌細胞轉入含10%胎牛血清的DMEM培養基內(100 mg/L鏈霉素，100 kU/L青霉素)，37℃，5% CO2培養，2～3 h后收集對數生長期細胞。qRT-PCR法檢測各組細胞miR-29a相對表達量。

細胞轉染及分組：對數生長期的細胞消化后接種于6孔細胞板(1×106個/孔)，當細胞融合至70%～80%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑盒說明書轉染，實驗分組：miR-29a過表達組(mimics)組，轉染終濃度為100 nmol/L，miR-29a mimics序列為5′-GTGGAGGGTCCGAGGT-3′；miR-29a陰性對照(NC)組，轉染終濃度為100 nmol/L，miR-29a mimics-NC序列為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；空白對照組(BC)不進行轉染。轉染48 h后，qRT-PCR法檢測轉染效率，篩選出穩定表達miR-29a細胞，培養48 h后，收集細胞檢測。qRT-PCR法檢測各組細胞miR-29a相對表達量。

1.3CKK-8法檢測細胞增殖情況 將穩定表達miR-29a的細胞接種至96孔板(5.0×104個/孔)，培養箱培養，分別于0、12、24、36、48、60、72 h后，按照說明書操作，加入CKK-8試劑，酶標儀(450 nm)檢測細胞光密度(OD)，繪制生長曲線。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 胰蛋白酶消化轉染后的各組細胞，經離心后收集、洗滌，加入annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)溶液，4℃避光孵育10 min后，上機檢測細胞凋亡率。FITC+/PI-為凋亡細胞，FITC-/PI-為活細胞，FITC+/PI+為壞死細胞，FITC-/PI+為機械損傷壞死細胞。細胞凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。其中，第1象限為機械性損傷細胞，第2象限為壞死細胞，第3象限為活細胞，第4象限為凋亡細胞。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期變化 胰蛋白酶消化轉染后的各組細胞，經離心后收集、洗滌，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，加入無水乙醇達到中濃度70%，固定細胞，4℃過夜，離心、洗滌后，PBS重懸，4℃避光反應30 min，流式細胞儀檢測細胞周期，計算各組細胞G0/G1期、S期、G2/M期細胞所占百分比。

1.6甲基化特異性PCR(MSP)法檢測細胞P16基因CpG島甲基化狀態 提取DNA，變性、純化后，根據試劑盒說明書進行MSP-PCR，檢測P16基因甲基化情況。MSP擴增后，甲基化：出現甲基化條帶，無非甲基化條帶；非甲基化：出現非甲基化條帶，無甲基化條帶；半甲基化：同時出現甲基化和非甲基化條帶。

1.7Western印跡檢測DNMT3b、p16 蛋白表達 收集1.2轉染后穩定表達miR-29a的細胞，提取總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白總量，利用Western印跡實驗檢測DNMT3b蛋白水平。

1.8熒光素酶報告基因檢測miR-29a對DNMT3b的調控 在線軟件TargetScan顯示人miR-29a可能與DNMT3b基因3′UTR區域結合，對含有該結合位點的DNMT3b基因3′UTR進行擴增，連到PGEM-T載體上，測序篩選，酶切連接至pGL4熒光素酶報告載體，構建野生型p-GL4-DNMT3b-wt和突變型p-GL4-DNMT3b-mut報告基因質粒。取1.2培養細胞于48孔板，24 h細胞貼壁后，將miR-29a mimics、miR-29a mimics-NC與pGL4、含熒光素酶報告基因p-GL4-DNMT3b-wt、p-GL4-DNMT3b-mut共轉染，24 h后，PBS漂洗，加入Passive lysis buffer裂解后，加入96孔板，在GloMax檢測儀檢測。

1.9統計學分析 采用SPSS20.00統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-29a在子宮頸癌細胞中的表達 子宮頸癌細胞SiHa(0.61±0.07)、Hela(0.53±0.04)、MSP175(0.69±0.08)中miR-29a的相對表達水平均較正常宮頸細胞HcerEpic(1.05±0.15)顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2miR-29a在 mimics轉染宮頸癌Hela細胞后相對表達量 miR-29a mimics轉染后，mimics組(13.25±0.86)Hela細胞中miR-29a的相對表達水平顯著高于NC組(0.98±0.03)和BC組(0.96±0.02)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡情況 mimics組(15.85±0.38)Hela細胞凋亡率較NC組(0.87±0.03)和BC組(0.85±0.02)顯著升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 細胞凋亡情況比較

2.4Hela細胞周期變化 流式細胞檢測結果顯示，mimics組G0/G1期細胞比例較NC組和BC組顯著升高(P<0.05)；3組S期及G2/M期細胞比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表1。

圖2 Hela細胞周期變化

表1 3組細胞周期比較

2.5MSP法檢測細胞P16基因CpG島甲基化狀態 mimics組Hela細胞P16基因CpG島甲基化率顯著低于NC組和BC組(P<0.05)。見圖3。

U：非甲基化；M甲基化圖3 MSP法檢測細胞P16基因CpG島甲基化

2.6Western印跡檢測DNMT3b、p16 蛋白表達 mimics組Hela細胞中DNMT3b蛋白表達量顯著低于NC組和BC組(P<0.05)，p16 蛋白表達量顯著高于NC組和BC組(P<0.05)。見圖4，表2。

圖4 Western印跡檢測DNMT3b、p16 蛋白表達

表2 3組DNMT3b、p16 蛋白表達

2.7熒光素酶報告基因檢測miR-29a對DNMT3b的調控 miR-29a mimics+p-GL4組熒光素酶活性強度(1.05±0.06)與miR-29a NC+p-GL4組(1.09±0.06)比較差異無統計學意義(P>0.05)；miR-29a mimics+p-GL4-DNMT3b-wt組熒光素酶活性強度(0.42±0.01)較miR-29a NC+p-GL4-DNMT3b-wt組(0.92±0.04)顯著降低(P<0.05)；miR-29a mimics+p-GL4-DNMT3b-mut組熒光素酶活性強度(0.85±0.02)與miR-29a NC+p-GL4-DNMT3b-mut組(0.87±0.03)差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

miR通過參與基因轉錄后調控在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。miR-29a在前列腺癌〔7〕、宮頸癌〔6〕腫瘤組織及細胞中表達水平降低。Hayes等〔8〕研究發現，過表達miR-29a可顯著抑制肝癌細胞生長。過表達miR-29a可抑制乳腺癌細胞增殖及遷移，提示miR-29a低表達可能參與乳腺癌腫瘤的發生與發展〔9〕。miR-29a在宮頸癌組織中表達下調，通過多種途徑發揮抗癌作用。Hela細胞中，miR-29a表達水平與抗癌基因p53活性負相關，過表達miR-29a可誘導p53依賴的細胞凋亡〔10〕。本研究結果表明轉染效果較好，提示過表達miR-29a可顯著抑制Hela細胞增殖，誘導細胞凋亡。進一步研究發現，過表達miR-29a可使細胞被阻滯在G0/G1期。抑癌基因啟動區CpG島高甲基化可能與宮頸癌發生有關〔11〕。P16基因在胃癌〔12〕、肝癌〔13〕等腫瘤中作為抑癌基因發揮作用，被稱為腫瘤抑制基因，其功能產物P16蛋白可負向調節細胞周期，阻止細胞進入DNA合成期，P16基因失活則會引起細胞增殖失控。在宮頸癌中，P16基因主要失活形式為CpG島甲基化。宮頸癌腫瘤細胞P16 CpG島甲基化發生率較宮頸炎組織細胞顯著升高〔14〕。多個研究顯示，DNMT3b表達水平升高與CpG島高甲基化正相關，DNMT3b可通過促進DNA高甲基化參與腫瘤發生、發展〔15,16〕。本研究結果提示過表達miR-29a可提高Hela細胞p16 蛋白水平。進一步研究提示過表達miR-29a可顯著減少P16 CpG島甲基化。

利用在線軟件TargetScan對miR-29a靶基因預測發現，DNMT3b是miR-29a靶基因。DNMT3b是機體內重要的從頭甲基化酶，可將DNA鏈中的C5胞嘧啶甲基化。DNA甲基化可沉默基因表達，而去甲基化則激活基因表達。DNMT在基因甲基化中發揮作用。研究表明，DNMT3b在膀胱癌〔17〕、肝癌〔18〕、乳腺癌〔19〕等多種腫瘤中表達水平升高。因此干擾DNMT3b蛋白表達，影響腫瘤細胞DNA的甲基化狀態，已成為新的癌癥靶向治療研究熱點。已有研究發現，轉染siRNA干擾DNMT3b表達可顯著抑制肝癌細胞生長及遷移，且能誘導肝癌細胞的凋亡〔20〕。另有研究表明，在肺癌細胞中過表達miR-29a可抑制DNMT3b mRNA及蛋白表達，從而重新激活因DNA甲基化而沉默的抑癌基因，抑制腫瘤生長，發揮抗癌作用〔21〕。本研究結果提示過表達miR-29a可能抑制DNMT3b表達。進一步研究提示miR-29a可靶向調控DNMT3b基因表達，過表達miR-29a可抑制DNMT3b基因轉錄和翻譯。