內耳異位再生毛細胞的ADF/destrin發育表達及其作用機制

涂澄宇 張亮 彭佳 (南昌大學第四附屬醫院耳鼻喉科，江西 南昌 330001)

哺乳動物的內耳毛細胞比較脆弱，極易遭受噪聲、毒素等因素的影響，導致其毛細胞受到損害，而這些受損的毛細胞無法自發再生，這也是它們后天出現獲得性耳聾的主要原因。destrin會通過化學當量促使纖維形肌動蛋白(F-actin)迅速實現解聚。現階段，由哺乳動物各類組織內純化得來的destrin，它會與F-actin原聚體相互結合，并把actin分子拆下來，并依托剪切、聚集到與之對應的F-actin〔1〕。新生或成年鼠內耳依然有部分細胞具備前體或者干細胞特征，上述細胞支持在體外培養條件下形成細胞球，并能夠分化為毛細胞樣細胞。與光感受器相比較，聽覺和前庭感覺上皮相似，出現更為復雜的感覺區，在以上感覺區主要任務在于合理平衡聲音、感受刺激，并通過化學信號轉化而來的毛細胞〔2〕。本文探究胚胎14.5 d直至其出生后4 d聽覺、半規管壺腹上皮發育中的ADF/destrin表達。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 青鏈霉素、谷氨酰胺均由Gibco公司提供；山羊、驢封閉血清均從MILLIPORE公司購入； 60 mm和100 mm培養皿、凍存管等產品均由Corning公司提供； 35 mm培養皿由Falcon公司提供；驢抗小鼠-Rho二抗(1∶200)、山羊抗小鼠cy5二抗(1∶200)；山羊抗兔-488二抗(1∶200)；ADF/destrin(兔來源單克隆抗體)(1∶100～1∶200)、E-cadherin(小鼠來源單克隆抗體)、Western印跡試劑盒(南京建成生物科技有限公司)、PCR試劑盒(大連TakaRa)等。

1.2孕鼠天數計算 挑選C57BL/6型生長健康的小鼠，雌、雄鼠數量依次為6只、2只，并于實驗的上午10點將3只雌鼠、1只雄鼠放到同一個窩內，24 h后分開以后，次日上午除掉胚胎計作E0.5，依次類推從同窩后第15天、19天分別計作E14.5、E18.5。實際實驗中，同窩后第15天、19天下午8點、6點所取的胚胎依次計作E14.5、E18.5。

1.3胚胎小鼠實施耳蝸處理 采用頸部脫臼把孕鼠處死后，通過剖腹方法快速將子宮取出，將其置于1×磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)溶液內，并對胚囊進行相應的剝離，把得到的胚胎放在直立熒光纖維鏡下把胚胎放入冰冷的4%多聚甲醛溶液內，并解剖內耳，將其固定到4%多聚甲醛溶液內，并在4℃冰箱內保存。

1.4耳蝸全基底膜鋪片 在顯微鏡下把固定完成的耳內移到1×PBS(pH7.4)溶液內實現解剖操作，將耳蝸基底膜完整的取出來，除掉表面蓋膜等，并將其放在0.1%TritonX-100的1×PBS溶液內室溫下進行20 min漂洗處理，并在48培養孔板中開展免疫染色處理。

1.5組織離體實施病毒培養 采用脫臼的方法將新生小鼠實施處死處理，并采用75%酒精完成消毒，并把顳骨聽泡部位取出并盛到經過滅菌處理的玻璃皿內，在鏡下將耳蝸基底膜取出來。由35 mm×10 mm培養皿中事先加入已經涂抹0.1%多聚萊氨酸蓋玻片，并增加1.0 ml的血清培養液中，移動基底膜保證匍匐貼壁。在37℃溫箱條件下實施孵育過夜。次日，把其換為無血清培養液，轉入Ad5-EGFP-math1或Ad5-EGFP病毒，促使其終濃度成為病毒(PFU)1.0×108。在此基礎上，根據組織貼壁細胞生長狀況每隔1 d、2 d更換1次培養液。在37℃環境的溫箱進行孵育，CO2濃度為5%，濕度控制為95%，并在轉入病毒后6 d、12 d取出培養皿觀察。

1.6開展掃描處理 利用Zeiss LSM510mets激光共聚焦的顯微鏡展開處理，依次設置不同的波長，分別為488 nm(FitC)、633 nm(cy5)、543 nm(rhodamin)的激光，對其進行40倍放大操作，從耳蝸基底膜自頂層慢慢向下完成掃描，設定層厚數值為0.5 μm，圖像分辨率設定為2 048×2 048。

1.7小鼠內耳毛細胞體外誘導分化體系建立及ADF/destrin敲除體獲得 取出實驗小鼠的內耳耳蝸，將其Cochlear組織小心放入35 mm的平皿中，加入適量無菌PBS緩沖溶液；在24孔板中，小心加入無菌的圓形小玻片，其直徑約為14 mm，并在小玻片上加入一定量的尾膠稀釋液，置于37℃中孵育15 min；接著，將內耳組織小心放入含有尾膠的24孔板中，再繼續加入1 ml的DMEM/F12培養基；輕輕的平穩的將24孔板小心置于培養箱中，整個過程保證耳蝸不動，緊密貼著鼠尾膠；小鼠cochlear培養過程中，可以加入適量100 mg/L 4-OH Tamoxifen誘導Cre活性；繼續培養7～10 d后，觀察并拍照。

1.8小鼠內耳毛細胞體外誘導分化體系建立 本研究參考劉亞青等〔3〕研究方法，成功地構建了小鼠內耳毛細胞體外誘導體系，其內耳支持細胞來源于Math1-GFP小鼠。ADF/destrin敲除體獲得是通過與生物公司合作，由生物公司上海斯萊克實驗動物有限公司構建。

1.9切片制作 先修整小鼠內耳組織，經流水沖洗30 min后，取掉多余固定液；接著依次將其浸泡在70%、80%、90%和100%的乙醇中各脫水1 h，在100%的乙醇中多脫水1 h；接著，在二甲苯中，使得腦組織透明化，處理2次，分別為15 min和10 min；最后，將其依次放入恒溫箱中，融化石蠟，每次1 h，重復3次。再將處理后的內耳組織按照順序包埋成塊狀，連續冠切片，每張切片保證其厚度約為5 um，切片完成后，用于后續組織形態學和免疫組化學檢測。小鼠內耳組織HE染色方法如下：將上述準備好的切片，浸入二甲苯中，2次，每次約為10 min；浸入100%乙醇中，2次，每次約為10 min；再依次浸入90%、80%、70%酒精及蒸餾水中，各約5 min；再用配制好的蘇木素染色液染色8 min，染色完成后，用自來水沖洗；分化20 s(由70%乙醇加1%鹽酸配制而成)后，浸入蒸餾水中處理5 min；接著按照70%、80%乙醇，浸泡5 min；再浸入含有90%伊紅醇溶液中，浸泡10 min；再浸入100%乙醇中，2次，每次5 min；再浸入二甲苯中，2次，每次5 min；最后，在中性樹膠中封片，顯微鏡下觀察。

1.10統計學處理 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1正常小鼠耳蝸基底膜中ADF/destrin表達 胚胎期14.5 d(E14.5)至出生后的第4天(P4)期間，ADF/destrin處于耳蝸中分布狀況。在E14.5狀態下，destrin 處于分散分布的狀況，且毛細胞和支持細胞均有與之對應的表達，如圖1所示。在出生后第1天(P1)時，destrin大多出現在毛細胞纖毛及其內指細胞中；P4時主要存在至此細胞質內有表達。

圖1 小鼠從胚胎至出生后各階段耳蝸中ADF/destrin表達(×200)

2.2dADF/destrin在小鼠內耳毛細胞體外誘導分化體系中的表達 隨著誘導時間的增加，Math1的表達量也在增加，同時，dADF/destrin的表達也在增加，并且在第6天達到高峰期。見表1，圖2。

表1 相關基因表達分析

圖2 Western 印跡檢測培養不同時間Math1、dADF/destrin表達水平

2.3敲除dADF/destrin抑制小鼠毛細胞發育 通過Cre/Loxp系統，成功地構建了小鼠dADF/destrin敲除體，當小鼠在E13～E15時，通過灌胃的方式，給予小鼠Tamoxifen，進一步誘導Cre活性。同時，當胎鼠為20 d時，通過組化法分析突變胎鼠的內耳表型。與正常小鼠相比，dADF/destrin敲除小鼠體積更小，發育遲緩，且內耳結構也有一定的絮亂。見圖3、圖4。

圖3 HE染色分析正常小鼠與敲除小鼠內耳結構(×200)

圖4 正常小鼠與敲除小鼠胚胎發育

3 討 論

哺乳動物內耳形態發生改變屬于比較比較復雜的過程，毛細胞是處在內耳的機械感受器細胞，可以把聲音、運動信號等轉換為電化學信號。哺乳動物的耳蝸毛細胞再生能力有一定的限制，利用藥物或基因干預可以對其實施恰當的修復。根據小鼠實驗結果可知，細胞周期蛋白大部分使用激酶抑制劑(CDKI)p27等，確保哺乳動物支持細胞可以順利進入細胞周期作為重要的調節因素〔4〕。為保證哺乳動物的毛細胞受到相應的損傷后可以及時修復，以上蛋白均可當做短暫性基因將靶標敲除?；诖耍ㄟ^逆轉錄病毒Atoh1因子保障成熟的細胞可以轉化為毛細胞。除此之外，異位再生毛細胞發育時期是否出現平面細胞極性(PCP)改變受到多數研究者的重視和關注。ADF/destrin屬于肌動蛋白解聚因子中不可缺少的一部分，其他成員包含cofilin2、cofilon1。ADF/destrin出現在海馬錐體細胞全部的興奮性突觸，且突出前、后結構均有出現，這為動物ADF/destrin相關問題研究提供一定的參考〔5〕。但ADF敲除突變體發生突觸前保留其生理功能之外，ADF失活并沒有影響動物的神經元及其他功能師傅恢復正常。通過研究野生型果蠅發育情況可知，視網膜細胞通過5倍的延長，tsr RS突變體因伸展階段缺失，導致黏附連接變寬〔6〕。

感覺細胞、成熟神經元大部分源自細胞表面，也稱為原纖毛細胞突起。原纖毛基體并沒有得到生產，在參與細胞分裂過程中有絲分裂紡錘體內，如果原纖毛發生有絲分裂前會受到再次吸收，這一細胞周期和纖毛形成密切的聯系，說明原纖毛發育環節發生細胞增殖及分化產生重要的影響。原纖毛具體功能展現在細胞天線上，其具體表現為及時接收細胞外信號，用于合理調節動物大腦發育狀況〔7,8〕。在上述研究背景下，原纖毛發育與出現疾病相關性成為研究的熱點問題，細胞表面突起多數參與機械刺激中，其主要缺點會使得部分器官出現功能性疾病。原纖毛作為化學及機械信號兩方面進行處理的感受器，它不單能夠整合細胞周圍信息，各整合操作發揮著重要的作用〔9〕。從某些分裂細胞視角分析，原纖毛對細胞是否要重新進入其周期并保持靜止狀態產生影響，使原纖毛發育一個關鍵的事件在于前體細胞/干細胞之間的不對稱分裂，進而發生相同或展現出不同命運的子代。有絲分裂過程中分裂面成為判斷肝細胞分裂是否對稱具有重要的影響，原纖毛極易對分裂后2個子代細胞有影響。隨著醫學界對原纖毛問題研究的更深入，能夠獲取關于感覺發育機制的新見解〔3,10〕。ADF失活并不會影響神經元分化及其突觸功能。本研究結果表明，耳蝸聽覺上皮及其前庭感覺上皮發育階段ADF/destrin出生4 d后主要出現在支持細胞中，這一情況與毛細胞、支持細胞負責的各功能有著緊密的聯系；本研究提示，這一時期動纖毛上肌動蛋白解聚活動非常強，之所以發生這種狀態，可能于動物的纖毛發育或退化情況有著密切的聯系。本研究結果還表明，ADF/destrin在橢圓囊、半規管壺腹毛細胞表皮板到小鼠出生后仍然有所表達，表明與前庭感覺上皮相比較，耳蝸聽覺發育更早。