基于Wnt/β-catenin信號通路的中醫藥調控骨代謝研究進展

蔡鑫 唐芳 馬武開 周靜 蘭維婭 李宇 蔣總 樊梅

(1貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002；2貴陽中醫學院第二附屬醫院)

骨組織生命活動周期包括骨吸收和骨形成，這一過程被稱為骨重塑，其中間充質干細胞(MSCs)分化為成骨細胞起主導作用〔1，2〕，對維持人體骨量和體液中鈣離子濃度十分重要。在骨重塑中，骨吸收與骨形成的協調失衡會導致骨質減少甚至骨質疏松，許多與骨代謝異常相關的疾病如骨質疏松、類風濕關節炎等的發生與骨質流失密切相關。Wnt/β-catenin通路是骨骼發育和骨骼內穩態的重要調節通路〔3～6〕，能調節Wnt途徑相關因子的表達，激活細胞向成骨細胞分化或使正常骨細胞代謝受抑制。其調控骨細胞生命過程具有雙面性，例如Wnt聯合受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5功能缺失使骨量下降，其激活突變則引起高骨量的發生；細胞厚體(DKK)1的高表達抑制骨形成，使用DKK1拮抗劑后可促進成骨分化。研究中醫藥調控Wnt/β-catenin信號通路與骨代謝相關機制已逐漸成為熱點，已有較多學者取得了一定成果，這對于發揮中醫藥潛在治療優勢具有重要意義〔7～10〕。

1 Wnt/β-catenin信號通路

在哺乳動物中已發現的Wnt蛋白家族成員至少有19種，大多數在細胞內誘發相應的特定作用，只有少部分具有相同功能。但是從生化層面來看，不同的Wnts對其表面受體卷曲蛋白(Fzd)的影響卻很相似，均與Fzd在富含半胱氨酸的N端相互作用而發揮生物效應〔11〕。Wnt/β-catenin信號通路的激活基于Wnt蛋白和其受體的結合，進一步決定了下游基因的表達〔12〕。在正常穩態下，被磷酸化的β-catenin與軸蛋白(Axin)、結腸腺瘤樣息肉病基因編碼的蛋白(APC)和糖原合成酶激酶(GSK)-3β組成降解復合物，在該復合物中β-catenin被泛素化標記并進一步降解，細胞內β-catenin水平較低〔13〕。Wnt/β-catenin信號通路被激活時，分泌出的Wnt蛋白通過結合跨膜受體Fzd和LRP5/6啟動信號傳導，誘導LRP5/6的尾部磷酸化，將Axin招募至細胞膜下并與磷酸化位點結合，Axin移除后，β-catenin在降解復合物中被蓬亂蛋白(Dsh)釋放出來，因此β-catenin在細胞質中聚集，最終轉移到細胞核，與T細胞因子/淋巴細胞增強因子(TCF/LEF)結合而啟動靶基因轉錄〔14，15〕。Wnt信號通路的拮抗劑如骨硬化蛋白(SOST)、Dickkopfs(DKK1/2/3)和分泌型卷曲相關蛋白(sFRP)1通過直接與Wnt蛋白結合或干擾Wnt蛋白與其受體間的相互作用而阻止β-catenin向核內移位〔16〕。

影響Wnt/β-catenin途徑的因素眾多，包括LRP5/6、多種由Wnt基因編碼的激活蛋白及一些抑制劑如SOST、Dickkopfs、sFRP1等，但是這些因子的共同作用靶點都是β-catenin，將胞質內的β-catenin降解失活或促使其轉移向核內與靶基因相互作用，調控經典Wnt/β-catenin通路。

2 Wnt/β-catenin信號通路與骨代謝

Wnt/β-catenin信號通路通過調節成骨細胞骨形成活性和破骨細胞骨吸收功能而調控骨代謝，對維持正常骨量至關重要，已有研究證實該通路是刺激成骨細胞增殖、分化活性的關鍵信號通路〔17～20〕。大量細胞和調節因子〔21〕參與維持骨重塑平衡，包括破骨細胞、成骨細胞、骨細胞和MSCs；Runt相關轉錄因子(Runx)2、Osterix轉錄因子、堿性磷酸酶(ALP)、一型膠原蛋白(COL1A1)等。在這些類型的細胞中，由多核細胞和MSCs分化而來的破骨細胞和成骨細胞分別負責骨吸收和骨形成〔22～24〕。

2.1骨形成 激活經典Wnt/β-catenin途徑能夠誘導成骨細胞的分化和礦化，抑制成骨細胞和骨細胞的凋亡而促進骨形成〔25～27〕。以β-catenin為代表的正向調控蛋白能激活下游TCF/LEF等因子促進骨細胞增殖〔28〕。有研究顯示Wnt蛋白通過與LRP5/6和Fz綁定，抑制GSK-3β活性而促進胞質β-catenin的穩定〔29〕。成骨細胞的分化可促進Runx2、Osterix、COL1A1等的表達和分泌〔30，31〕。Runx2在成骨細胞分化中直接與成骨細胞關鍵性特異基因的啟動區域相互作用促進成骨細胞發育〔32〕。COL1A1是由成骨細胞分泌產生的糖蛋白，為骨細胞外基質的重要組成部分，共同在骨重塑中發揮重要作用〔33〕。Runx2和Osterix調控著多種成骨細胞標記基因的表達，如ALP和COL1A1〔34〕。胡中青等〔35〕證實通過激活Wnt/β-catenin信號通路能上調RunxZ和Osterix表達，有效促進骨髓MSCs(BMSCs)向成骨分化發育、改善骨缺損。

2.2骨破壞 Glass等〔36〕在對老鼠基因的研究中首次報道了Wnt/β-catenin信號通路對于破骨細胞的重要性，下調細胞內β-catenin的表達會影響MSCs向成骨細胞分化，導致骨形成能力減弱，骨密度下降〔37，38〕。LRP5是骨重塑關鍵調控因子，此基因缺失會使成骨增殖分化功能下降〔39〕。小鼠骨組織內DKK1呈高水平表達時，成骨分化明顯受到抑制〔40〕。Osterix特定表達在發育骨骼中，當其被選擇性敲除后會導致小鼠骨形成障礙，對調控骨形成和骨吸收有重要意義〔41，42〕。Sclerostin是一種由SOST基因編碼，經骨細胞分泌產生糖蛋白，通過與成骨細胞上LRP5/6的細胞外區域結合抑制經典Wnt/β-catenin通路，從而負向調控骨形成〔43〕，而使用SOST拮抗劑可增加骨形成和減少骨吸收，使骨質量、骨密度迅速增加〔44〕，并且這一結果已在臨床人體試驗中得到肯定〔45，46〕。此外，多種其他類型Wnt信號通路拮抗劑在骨骼代謝中抑制成骨分化的作用也在小鼠模型中被證實〔47〕。

3 中醫藥調控Wnt/β-catenin信號通路與骨代謝

中醫藥通過Wnt/β-catenin信號通路調控骨代謝的機制較為復雜，對該通路中相關調控因子產生復合影響而非只對單一蛋白起作用。當前的研究主要是單味中藥有效提取物和中藥復方制劑，所影響的調節因子廣泛，包括正向調控因子Wnts、LRP5、Runx2和負向調節蛋白DKK1、SOST、GSK-3β等。

3.1中醫藥干預正向調控因子

3.1.1Wnt蛋白與骨代謝 BMSCs通過自身較強的自我更新和多向分化能力而維持機體骨量，具有低免疫原性和易獲取等特點〔48，49〕。復方貞術調脂膠囊能有效提高骨組織中Wnt3a表達，經干預后的BMSCs中促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MEKK)2和β-catenin蛋白表達明顯上調，說明該方通過調控MEKK2-Wnt耦聯抑制β-catenin被降解而促進成骨分化〔50〕。章建華等〔51，52〕以骨質疏松(OP)腎陰虛和腎陽虛兩種證型為研究點，發現左歸丸和右歸丸含藥血清均能上調大鼠成骨細胞中β-catenin mRNA和蛋白表達，提升ALP的活性，對成骨細胞增殖具有積極作用。但是左歸丸對于腎陰虛證型OP成骨細胞的促進作用更明顯，而腎陽虛證型OP中右歸丸的效果更強，與“左歸丸補腎陰，右歸丸補腎陽”的經典中醫理論相符。氧化應激會誘導成骨細胞凋亡使骨量下降而引發OP，叉頭框O蛋白家族(FoxO)在此過程中起關鍵作用，FoxO和β-catenin結合后，β-catenin與TCF的轉錄作用被競爭性抑制而減少成骨細胞形成〔53，54〕。激活Wnt/β-catenin信號通路能抑制上述反應過程〔55，56〕，成鵬等〔57〕構建去卵巢大鼠OP模型，觀察到經黃芪甲苷干預后用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測得Wnt2a和β-catenin蛋白表達水平明顯上調，FoxO蛋白家族成員FoxO3a表達受到抑制，能有效調節成骨細胞代謝、改善大鼠骨量減少所致的OP。

3.1.2LRP5與骨代謝 陳云剛等〔58〕使用骨碎補含藥血清干預大鼠BMSCs，發現其通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調LRP5、β-catenin mRNA和蛋白表達及提升ALP的活性，促進BMSCs向成骨分化。DKK1的高表達會抑制成骨細胞代謝，何幫劍等〔59〕發現益骨湯含藥血清能有效提高大鼠骨組織LRP5基因表達而促進成骨細胞增殖，這可能與抑制經典Wnt/β-catenin通路中DKK1的表達有關。彭昕等〔60〕采取由補骨脂丸為原方而研制出的壯骨止痛膠囊〔61〕干預體外培養大鼠顱骨成骨細胞的方法，觀察到藥物組LRP5和β-catenin蛋白表達明顯升高，可能具有與雌激素相似的治療絕經后OP的作用。還有學者發現益骨湯含藥血清也能通過上調骨組織Wnt/β-catenin信號通路LRP5、β-catenin mRNA和蛋白的表達來促進成骨細胞增殖〔59〕。

3.1.3Runx2與骨代謝 史巖等〔62〕用RT-PCR法檢測經骨碎補黃銅干預后的體外培養大鼠BMSCs，結果顯示Runx2、β-catenin mRNA表達明顯上調，表明該方通過上調Wnt/β-catenin通路關鍵活化因子表達來促進BMSCs向成骨細胞分化。在另一項研究中也發現通過提高Runx2的表達有利于成骨分化〔58〕。黃精多糖可激活經典Wnt/β-catenin通路而促進MSCs成骨分化〔63〕，彭小明等〔64〕進一步證實黃精多糖能明顯提升成骨關鍵轉錄因子Runx2、ALP活性，激活β-catenin易位到細胞核與成骨靶基因Runx2結合啟動轉錄。益骨湯具有上調大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號通路成骨分化核心蛋白Runx2表達而調控成骨增殖過程的作用〔65〕。銀杏葉提取物通過刺激Runx2基因表達和提高ALP活性對細胞成骨分化起積極作用，COL1A1、β-catenin等蛋白表達也明顯上調〔66〕。

3.2中醫藥干預負向調控因子

3.2.1DKK1與骨代謝 成骨細胞增殖分化活性能被破骨細胞間接抑制而使骨量減少〔67〕，清熱活血方可以顯著下調類風濕關節炎大鼠模型滑膜與血清中DKK1 mRNA和蛋白表達，通過Wnt/β-catenin通路調節破骨細胞與成骨細胞的分化平衡來抑制骨破壞〔68〕。楊文雪等〔69〕發現補腎舒脊顆粒通過上調DKK1和SOST而抑制強直性脊柱炎患者受累關節骨化過程，同時抑制Wnt5a和β-catenin mRNA表達，影響Wnt通路對骨細胞的調控，這與鄢澤然等〔70〕的研究結果一致。使用菟絲子黃酮混懸液灌胃去卵巢大鼠一方面抑制了DKK1的表達、增強成骨分化，另一方面能提升血液中β-catenin水平、抑制破骨細胞成熟〔71〕。張志達等〔72〕研究左歸丸對糖皮質激素性OP大鼠骨量的影響，結果顯示左歸丸能較好改善骨質量，其機制可能是通過下調DKK1 mRNA表達、增強成骨細胞活性而發揮抗OP作用。

3.2.2SOST與骨代謝 補腎健脾活血方不僅能提高被沉默SOST腺病毒載體傳染的成骨細胞增殖能力和ALP活性，上調骨保護素和骨橋蛋白表達，而且當過表達SOST感染后也能取得類似的干預效果，表明該方可能是通過調控Wnt信號通路中SOST的表達來發揮骨重建作用〔73，74〕。柴生颋等〔75〕通過建立sFRP1高表達及沉默組基因載體并聯合補腎方藥含藥血清干預大鼠骨肉瘤細胞，發現補腎方藥在一定程度上抑制sFRP1的表達，提高細胞中β-catenin蛋白水平而調控骨代謝。

3.2.3GSK-3β、Axin與骨代謝 有學者使用刺老苞根皮含藥血清干預體外培養的大鼠成骨細胞后，經Western印跡和熒光定量PCR法測得Axin mRNA和蛋白表達明顯下調，有效提高了β-catenin mRNA和蛋白表達，成骨分化與增殖功能得到加強，其機制可能與由Axin、β-catenin、APC、GSK-3β等組成的降解復合物被破壞相關〔76〕。張哲等〔77〕采取老鸛草素干預小鼠BMSCs的方法研究其作用機制，發現經藥物作用后GSK-3β mRNA和蛋白表達明顯下調，同時激活Wnt3a蛋白的表達，而DKK1可以抑制該過程，說明老鸛草素是通過激活Wnt3a/β-catenin通路發揮誘導BMSCs增殖和向成骨方向分化的作用；而涂艷等〔78〕則發現淫羊藿苷能上調GSK-3β mRNA表達，提升β-catenin和Wnt10a等蛋白水平來調控BMSCs向成骨分化。此外也有研究顯示淫羊藿苷能抑制破骨細胞活性，用于治療骨量下降誘發的OP有較好效果〔79，80〕。

綜上所述，基于中醫藥調控Wnt/β-catenin影響骨代謝的機制十分復雜，既可通過上調正向調控因子mRNA和蛋白的表達來促進成骨細胞增殖分化，維持正常的骨量；也能拮抗該通路負向調節因子的表達而抑制破骨細胞活性，使骨形成和骨吸收這一骨重塑過程穩定在動態平衡狀態。目前采用針對Wnt/β-catenin信號通路的生物制劑進行治療骨代謝病已表現出較好的早期效果，并可能在不久的將來進入臨床領域，如抗DKK1蛋白抗體等治療藥物的研發不僅可以促進骨形成，還有望逆轉骨質疏松、類風濕關節炎等造成的骨質流失。中醫藥可調節的Wnt/β-catenin骨代謝相關轉錄因子較多，如果能對其干預機制有更深層次、更詳盡的認識，這相對于干預單一靶基因可能效果更佳。因此，中醫藥治療骨代謝性疾病具有極大的潛力，應當進一步增強研究力度，充分研發并使之臨床應用成為現實。