循環(huán)腫瘤細胞在肝癌中的應(yīng)用進展

胡盼 劉瑩 咸蕾 王鑫森 李佳睿

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

肝癌在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位〔1〕。盡管針對肝癌已有諸多治療措施，但由于大多數(shù)患者診斷延遲，發(fā)現(xiàn)時已達中晚期，導(dǎo)致肝癌患者治療后的預(yù)后較差，而根本原因即是腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移〔2〕。目前所能發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移灶大多數(shù)是通過計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)或正電子發(fā)射計算機斷層顯像(PET-CT)等影像檢測手段，但此時往往進入了腫瘤晚期。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指由原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶通過血管侵犯而侵入癌癥患者外周血液中的腫瘤細胞〔3〕。早在1869年，Ashworth就在1例乳腺癌患者尸檢過程中發(fā)現(xiàn)了外周血中存在腫瘤細胞，隨著近年來分子生物學(xué)及檢測技術(shù)的發(fā)展，CTCs成為腫瘤早期轉(zhuǎn)移及治療術(shù)后復(fù)發(fā)領(lǐng)域研究的熱點〔4,5〕。已知，CTCs在乳腺癌、肺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)及預(yù)后的預(yù)測中起著重要作用，但其在肝癌中的研究應(yīng)用還遠不及這些腫瘤類型。本文著重探討肝癌CTCs的檢測及其對肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的預(yù)測作用。

1 CTCs的富集

對于CTCs來說，從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的釋放率尚未得知，已有實驗?zāi)Ｐ捅砻鳌?〕，數(shù)以百萬計的腫瘤細胞將會被釋放到血液循環(huán)中，但最終僅僅有數(shù)量相當少的細胞可以成功地轉(zhuǎn)移到遠處器官，逃避宿主免疫，保持休眠狀態(tài)，待錨定器官微環(huán)境適合時侵入，形成肉眼可見的轉(zhuǎn)移病灶。究其原因〔7〕，首先，大量的血細胞及血流造成的剪切力會顯著減少CTCs的數(shù)量；其次，宿主的自身免疫系統(tǒng)也會檢測到一部分腫瘤細胞，并將其清除；最后，腫瘤細胞若在血流中存活，還必須逃避失巢凋亡的過程。綜上，外周血液中CTCs的數(shù)量十分有限，通常每106～107個血細胞中，只能找到一個CTCs。因此，CTCs富集技術(shù)的靈敏度和特異性也是成功檢測CTCs的關(guān)鍵。CTCs的富集策略可按照依賴其物理特性和生物特性分為兩大類，前者主要是根據(jù)CTCs的密度、體積、形狀等有別于其他血液細胞的特點而將其分離，后者主要是根據(jù)CTCs的表面存在諸多特異性的抗原，利用抗原-抗體反應(yīng)將其富集。

1.1密度梯度離心法 此方法是根據(jù)各種細胞在血液中的密度存在差異，通過離心的方法，將CTCs濾出。通過離心，紅細胞、中性粒細胞及單核細胞被分離至不同層面，腫瘤細胞位于最上層。目前常用的細胞密度梯度介質(zhì)為Ficoll和Onco Quick，有研究報道〔8〕，后者較前者具有更高的靈敏度。密度梯度離心法具有便捷、廉價、易操作，且不會破壞細胞結(jié)構(gòu)等優(yōu)點，但其靈敏度較低，容易摻雜其他細胞，也容易造成CTCs的丟失，形成假陰性的結(jié)果，因此在實際應(yīng)用過程中，此方法常常作為檢測CTCs的前期工作基礎(chǔ)。

1.2濾過分離法 濾過法以CTCs的直徑大于其他血液細胞為依據(jù)，而實現(xiàn)CTCs的富集。Vona等〔9〕發(fā)明了上皮腫瘤細胞大小分離(ISET)方法，通過聚碳酸酯膜來過濾血液，使得CTCs與血液中的其他細胞分離。該種方法與密度梯度離心法類似，因此只作為前期步驟。

1.3免疫磁珠分離法 免疫磁珠分離法的基本原理為：將細胞表面相關(guān)抗原的抗體包被于具有順磁性的磁珠表面，這樣磁珠就會通過“磁珠/抗體-抗原/細胞”與細胞結(jié)合，外加強大磁場，目標細胞就會與其他細胞分離。基于此原理，免疫磁珠分離法可以分為陽性分離法和陰性分離法。陽性分離法是將磁珠與CTCs表面抗原結(jié)合而直接分離CTCs的過程，而陰性分離法是將磁珠與血液細胞表面抗原結(jié)合而間接分離CTCs的過程，例如白細胞表面的特異性CD45抗體。陽性分離法具有代表性的方法被美國FDA批準用于臨床的Cell Search系統(tǒng)，Cell Search系統(tǒng)檢測的原理是基于大部分實體腫瘤細胞表面均表達上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗原，以此為靶點進行富集CTCs〔10～13〕。肝癌雖然為上皮起源的腫瘤，但由于其向遠處侵襲過程中會發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，相應(yīng)的上皮細胞表面抗原也會向間質(zhì)細胞表面抗原轉(zhuǎn)化，因此肝癌細胞表面的上皮細胞標志物EpCAM表達水平相對較低〔14,15〕，該系統(tǒng)并不適用于肝細胞肝癌CTCs的監(jiān)測。Xu等〔16〕利用去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體來包裹磁珠，成功地從85例肝細胞癌患者中檢測出69名CTCs陽性患者，而在健康體檢者、良性肝臟腫瘤以及非肝細胞性肝癌患者中未檢測出CTCs。

1.4Can Patrol系統(tǒng) 最近，由我國自主開發(fā)的Can Patrol系統(tǒng)檢測肝細胞肝癌患者CTCs彌補了肝細胞肝癌研究領(lǐng)域的不足，該系統(tǒng)通過有機結(jié)合納米技術(shù)和多重RNA原位分析(RNA-ISH)技術(shù)，對CTC的分離不依賴于特定生物標志物，大大提高了CTCs的回收率〔17〕。此外，與Cell research為代表的一代CTCs富集技術(shù)相比，Can Patrol系統(tǒng)不僅克服了Cell research技術(shù)只能分離獲得某一特定表型CTCs的缺陷，同時完全實現(xiàn)了對所有腫瘤表型CTCs的分離與鑒定〔18,19〕。

2 CTCs的識別

2.1形態(tài)分析與免疫組化 Cell Search系統(tǒng)將≥4 μm、DAPI+、角化蛋白(pan-keratin)+及CD45-的細胞判定為CTCs。Nam等〔20〕應(yīng)用細胞團塊聯(lián)合多重免疫組化的方法，檢測了肌酸激酶(CK)、EpCAM、上皮細胞膜抗原(EMA)、重組人細胞角蛋白(CK)18、肝細胞單克隆抗體(HepPar)-1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(Glypican)-3及甲胎蛋白(AFP)，29例肝癌患者檢出率為48.3%，但是CK、EpCAM、Gypican3及AFP陽性的CTCs大部分存在于具有上皮細胞特征的肝癌細胞系中，對于發(fā)生EMT的肝癌細胞，可能會有遺漏。由于肝癌在侵襲過程中的異質(zhì)性，很難確定肝癌CTCs的特異性標志物，因此，這也是此種方法的局限性所在。

2.2特異性核酸分析法 特異性核酸分析法并不是直接找到腫瘤細胞，而是通過在外周血中找出腫瘤細胞的特異性核酸，而間接證實CTCs的存在。因此，核酸表達的特異性直接反映了此方法的可靠性。因為肝癌細胞與正常的上皮細胞有著相同的EpCAM，所以，大大降低了依賴于EpCAM分離CTCs的特異性，Jin等〔21〕通過在EpCAM免疫磁珠技術(shù)分選后的CTCs中檢測AFP mRNA的水平，提高了CTCs檢測的靈敏性及特異性。但是，由于血流中存在游離的腫瘤細胞DNA，此種方法很有可能形成假陽性的結(jié)果。

3 CTCs與肝癌

3.1CTCs與肝癌的治療 肝癌的治療手段頗多，手術(shù)切除、肝移植、肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)、射頻消融術(shù)(RFA)、微波消融術(shù)(MWA)、放療等。Fang等〔22〕利用EpCAM免疫磁珠法檢測TACE圍術(shù)期患者外周血及右心房血中CTCs的數(shù)量，結(jié)果表明兩組患者TACE術(shù)前與術(shù)后相比均無統(tǒng)計學(xué)差異，而右心房中的CTCs要多于外周血。Sun等〔23〕通過檢測123名行手術(shù)切除的肝細胞癌患者術(shù)前及術(shù)后1個月的CTCs發(fā)現(xiàn)，術(shù)前7.5 ml血液中CTCs≥2個的患者要比CTCs<2個的患者復(fù)發(fā)早，并且CTCs≥2個是腫瘤復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子。

3.2CTCs與肝癌的預(yù)后 血行轉(zhuǎn)移是肝癌常見的轉(zhuǎn)移形式，因此肝癌患者血液中的CTCs與其預(yù)后有直接關(guān)系。CTCs與患者的總生存期、無進展生存期、腫瘤分期等相關(guān)聯(lián)。Schulze等〔24〕發(fā)現(xiàn)，EpCAM+的CTCs陽性患者總生存期(OS)較CTCs陰性患者短，且與巴塞羅那(BCLC)分期呈正相關(guān)，提示CTCs陽性影響肝癌患者的預(yù)后。Nel等〔25〕通過對行選擇性內(nèi)放射治療(SIRT)的肝癌患者CTCs進行檢測，報道胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-1 mRNA的水平與進展時間(TTP)相關(guān)，認為CTCs可以作為肝癌患者個體化治療的新型分子標志物。Chen等〔26〕回顧分析了195位肝細胞癌患者的CTCs水平及分型得出結(jié)論，總CTCs數(shù)量與BCLC分期、轉(zhuǎn)移及血清AFP水平相關(guān)，并且復(fù)發(fā)的患者含有更高混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs，表明CTCs的數(shù)量和EMT的分型與肝癌的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。

4 總結(jié)與展望

肝癌的轉(zhuǎn)移起始于原發(fā)灶內(nèi)的腫瘤細胞擴散到血液中，隨后等待時機，侵襲遠處器官形成轉(zhuǎn)移。隨著科學(xué)的發(fā)展，釋放入血的CTCs已經(jīng)可以被有效富集和檢測，但由于肝癌的異質(zhì)性及在轉(zhuǎn)移過程中EMT的發(fā)生，導(dǎo)致肝癌CTCs的檢測方法尚未形成共識。而由于檢測方法不一，致使各位學(xué)者對CTCs在肝癌的治療及預(yù)后方面的看法也有少許出入。因此肝癌CTCs檢測技術(shù)的改進和完善及如何將其應(yīng)用于臨床實際工作中，將仍然是未來的熱點話題。希望基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究者能夠更加深入的探索CTCs的相關(guān)知識，并最終改善患者預(yù)后，為肝癌的診治提供新方法、新策略。