鋅指蛋白-2對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞放射敏感性及順鉑敏感性的影響

黃東恒 馬彥凝 馮惠怡 朱鳳盈 于新發(fā)，2

1廣東醫(yī)科大學(xué)（廣東湛江524002）；2南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院腫瘤科（廣東順德528300）；3南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院放射治療科（廣東順德528300）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，我國(guó)鼻咽癌的發(fā)病率和病死率高于世界平均水平，付振濤等報(bào)道2014年我國(guó)鼻咽癌發(fā)病率為3.26/10萬(wàn)，病死率為1.77/10萬(wàn)，死亡病例約占全球鼻咽癌死亡病例的40%[1]。放療是鼻咽癌首選的治療方法，單純放療及同步放化療是臨床上治療鼻咽癌的主要手段[2]，雖然以適形調(diào)強(qiáng)放射治療為代表的治療應(yīng)用于臨床使得原發(fā)鼻咽癌的治療效果顯著提高，但仍有19%～56%的患者在放療后5年內(nèi)發(fā)生局部復(fù)發(fā)，特別常見于晚期鼻咽癌患者，一旦出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，雖然可采取再程放化療等綜合治療措施[3]，但再程放療容易產(chǎn)生較嚴(yán)重并發(fā)癥，獲益有限[4]，因此提高鼻咽癌放射敏感性及對(duì)化療藥物的敏感性具有重要意義。

小腦鋅指結(jié)構(gòu)可表達(dá)鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，最早由ARUGA等[5]于1994年在成年鼠的小腦中發(fā)現(xiàn)，因小腦顆粒細(xì)胞里大量表達(dá)鋅指蛋白而得名。Zic基因家族成員包括了5個(gè)成員Zic1～5，其中鋅指蛋白-2（Zinc finger protein 2，Zic2）已被證明作為癌基因在骨肉瘤[6]、胰腺癌[7]、乳腺癌[8]、急性髓系白血病[9]、前列腺癌[10]等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用。還有研究發(fā)現(xiàn)HOXA10通過(guò)誘導(dǎo)Zic2的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]，然而Zic2對(duì)鼻咽癌放射敏感性及順鉑敏感性的影響尚未見報(bào)道。本研究主要探討Zic2對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞放射敏感性及順鉑敏感性的影響，研究Zic2在鼻咽癌放射抵抗性細(xì)胞中表達(dá)情況，明確Zic2表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性及順鉑敏感性的相關(guān)性，為放化療增敏提供分子理論基礎(chǔ)，旨在為鼻咽癌的治療尋找新的靶標(biāo)，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料人CNE2細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心提供；RPMI-1640、胎牛血清、Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Apexbio公司；Zic2抑制物（siRNA）購(gòu)自吉瑪公司；Lipofectamine?3000購(gòu)自Invitrogen公司；0.25%胰酶購(gòu)自廣州晶欣公司；westem blot實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；兔抗人Zic2單克隆抗體（ab150404）購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶二抗、β-Actin內(nèi)參抗體購(gòu)自美國(guó)Earthox公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自美侖生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CNE2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及照射用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合至80%～90%后胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于六孔板中，待貼壁后通過(guò)Lipofectamine?3000將Zic2 siRNA轉(zhuǎn)染至CNE2細(xì)胞中（siZic2：5′-GGCAAAGUCUUCGCGCGCUTT-3′，5′-AGCGCGCGAAGACUUUGCCTT-3′；NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）。細(xì)胞貼壁后，在培養(yǎng)板下方墊1 cm厚的凡士林膠，大機(jī)頭180°，源皮距100 cm，6 MV的X射線，吸收劑量率為300 cGy/min（Varian），經(jīng)從下往上垂直照射。

1.2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力變化轉(zhuǎn)染24 h后，分別將轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA組及陰性對(duì)照組的CNE2細(xì)胞以每孔1 000個(gè)/100 μL接種到96孔板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，連續(xù)5 d加入10 μL CCK-8溶液作用1 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上450 nm處測(cè)定各孔吸光度值。以培養(yǎng)日期為X軸，OD值為Y軸，繪制兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性轉(zhuǎn)染24 h后，將CNE2細(xì)胞以每孔2 000個(gè)/100 μL接種到96孔板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后加入含各種濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）順鉑的10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后加入10 μL CCK-8溶液作用1 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上450 nm處測(cè)定各孔吸光度值。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)后計(jì)算出各A450平均OD值，并計(jì)算各濃度順鉑作用下的細(xì)胞抑制率。

1.2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞放射敏感性的測(cè)定

1.2.4.1 CCK-8實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后，將CNE2細(xì)胞以每孔2 000個(gè)/100 μL接種到96孔板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后行2 Gy劑量的X線照射，對(duì)照細(xì)胞同等條件處理但不照射；照射后分別于第1、2、3、4、5天加入 10 μL CCK-8溶液作用1 h，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)后計(jì)算出各A450平均OD值，并計(jì)算細(xì)胞百分存活率。

1.2.4.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后，按不同照射劑量，接種細(xì)胞于6孔板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。貼壁后分別用0、2、4、6、8 Gy的X線照射，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見集落，甲醇固定15 min，PBS洗滌，0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)≥50的集落，計(jì)算各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。

1.2.5 建立并驗(yàn)證放射抵抗性細(xì)胞系取指數(shù)生長(zhǎng)期CNE2細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液種植于6孔板中，種植細(xì)胞密度為4.0×104個(gè)/孔，貼壁后照射8 Gy繼續(xù)培養(yǎng)，挑選出存活亞克隆細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)后重復(fù)以上過(guò)程給予6 Gy共3次及8 Gy 1次照射，命名為CNE2-R，待細(xì)胞穩(wěn)定常規(guī)傳代5次后用于以下實(shí)驗(yàn)：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本株CNE2細(xì)胞及放射抗拒株CNE2-R細(xì)胞分別稀釋成2 000個(gè)/100 μL接種于96孔板內(nèi)，用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各孔OD值并繪制親本株及放射抗拒株細(xì)胞經(jīng)6 Gy照射后0～7 d的細(xì)胞增殖曲線。克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算兩株細(xì)胞系經(jīng)不同劑量照射后各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，整個(gè)照射及培養(yǎng)過(guò)程歷時(shí)8個(gè)月。

1.2.6 提取總蛋白及Westernblot分析 轉(zhuǎn)染48 h后，提取轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA與陰性對(duì)照組CNE2細(xì)胞的總蛋白、提取CNE2-R與CNE2細(xì)胞總蛋白及提取未照射的CNE2與照射6 Gy后24 h的CNE2細(xì)胞總蛋白。10%的SDS-PAGE電泳分離蛋白，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h。將膜分別放置于1∶5 000體積稀釋的Zic2單克隆抗體和1∶5 000體積稀釋抗β-Actin單克隆抗體中4℃過(guò)夜。PBST洗膜后置于1∶5 000體積稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中室溫下孵育2 h。PBST洗膜后，用ECL試劑發(fā)光及顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prime 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值±標(biāo)準(zhǔn)差記錄數(shù)據(jù)并繪制相關(guān)曲線。比較組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)分析（P＜0.05）。擬合多靶單擊模型計(jì)算相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)來(lái)比較兩株細(xì)胞系的放射敏感性。

2 結(jié)果

2.1 Zic2對(duì)CNE2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響通過(guò)繪制陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA的CNE2兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達(dá)后細(xì)胞增殖率降低（P＜0.01），見圖1。

圖1 CCK-8檢測(cè)抑制Zic2表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of inhibition of Zic2 expression on proliferation of CNE2 cells

2.2 Zic2對(duì)CNE2細(xì)胞順鉑敏感性的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)出轉(zhuǎn)染Zic2 siRNA組與對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)各濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）順鉑作用24 h及48 h后的OD值并計(jì)算相應(yīng)的抑制率，發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達(dá)的CNE2細(xì)胞經(jīng)不同濃度的順鉑作用后，細(xì)胞抑制率較對(duì)照組明顯提高（P＜0.05），見圖2。

圖2 CCK-8檢測(cè)抑制Zic2表達(dá)對(duì)CNE2細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的影響Fig.2 Effect of inhibition of Zic2 on sensitivity of CNE2 cells to Cisplatin

2.3 Zic2對(duì)CNE2細(xì)胞放射敏感性的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制Zic2表達(dá)的CNE2細(xì)胞經(jīng)不同劑量X線照射后，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯下降，通過(guò)多靶單擊模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并求出細(xì)胞放射敏感性參數(shù)D0（平均致死劑量）、Dq（準(zhǔn)閾劑量）和N值（靶數(shù)）以及照射2 Gy后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達(dá)的CNE2細(xì)胞SF2、Do、Dq、N均變小，放射增敏比（SER）為1.483，說(shuō)明抑制Zic2表達(dá)后的CNE2細(xì)胞具有更高的放射敏感性。見表1。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)2Gy照射后，抑制Zic2表達(dá)的CNE2細(xì)胞的存活率低于陰性對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 CCK8檢測(cè)抑制Zic2表達(dá)后照射2 Gy對(duì)CNE2細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of inhibition of Zic2 on survival rate of CNE2 cells after 2 Gy irradiation

表1 多靶單擊模型擬合的放射生物學(xué)參數(shù)值Tab.1 Paremeter values of Single-hit Multi-target model fitting

2.4 CNE2與CNE2-R細(xì)胞放射敏感性的比較CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CNE2與CNE2-R細(xì)胞在接受6Gy的X射線照射后，兩株細(xì)胞緩慢增殖，但照射第5天后，CNE2細(xì)胞迅速死亡，而CNE2-R細(xì)胞則繼續(xù)緩慢生長(zhǎng)，表現(xiàn)出更高的生存率，兩種細(xì)胞增殖情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE2-R細(xì)胞較親本CNE2細(xì)胞 SF2、Do、Dq、N 變大，具有較高的放射抵抗性，見表2。

圖4 CNE2與CNE2-R照射6Gy后細(xì)胞的增殖曲線Fig.4 Proliferation of CNE 2 and CNE 2-R after irradiated 6 Gy

表2 多靶單擊模型計(jì)算CNE2與CNE2-R的放射生物學(xué)參數(shù)Tab.2 Paremeter values of Single-hit MμLti-target model fitting

2.5 Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Zic2蛋白的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Zic2抑制物siRNA可顯著降低CNE2細(xì)胞中Zic2的蛋白表達(dá)，證明成功轉(zhuǎn)染，見圖5A。與親本細(xì)胞株CNE2比較，放射抵抗性細(xì)胞CNE2-R的Zic2蛋白明顯高表達(dá)，見圖5B。經(jīng)6 Gy劑量X線照射CNE2細(xì)胞24 h后與未照射細(xì)胞比較，照射后的CNE2細(xì)胞Zic2蛋白表達(dá)水平高于未經(jīng)照射的細(xì)胞，見圖5C。

圖5 Zic2蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig.5 Western blot results of Zic2 expression

3 討論

許多抗癌藥物是通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞DNA來(lái)達(dá)到治療的目的，但腫瘤細(xì)胞可以激活自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，從而對(duì)DNA損傷藥物產(chǎn)生耐藥[12]。順鉑是臨床上治療鼻咽癌最常用的化療藥物，所以選擇順鉑進(jìn)行研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA以抑制CNE2細(xì)胞中Zic2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達(dá)后CNE2細(xì)胞的增殖能力下降，且明顯提高CNE2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。LU等[13]研究發(fā)現(xiàn)Zic2-PAK4可導(dǎo)致肝細(xì)胞癌預(yù)后不良，Zic2與PAK4的表達(dá)呈正相關(guān)，PAK4可通過(guò)PI3K/Akt-和MEK/ERK-依賴途徑使胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性[14]，許多腫瘤過(guò)度激活的PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[15]，因此推測(cè) Zic2-PAK-PI3K/Akt途徑可能降低鼻咽癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，從而影響鼻咽癌的治療效果。

腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的放射線反復(fù)照射之后，某些基因、蛋白質(zhì)等表達(dá)異常可降低腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，進(jìn)而發(fā)生放射抵抗[16-17]，放射抵抗細(xì)胞有較強(qiáng)的輻射損傷修復(fù)能力，從而導(dǎo)致腫瘤放療效果欠佳。因此，尋找NPC放射抵抗的相關(guān)基因、蛋白質(zhì)，揭示NPC的放射抵抗機(jī)制，尋找降低放射抵抗性靶點(diǎn)從而提高NPC治療效果具有重要意義。賀玉香等[18]研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2在射線照射后，Ku70、Ku80和DNA-PKcs的表達(dá)水平明顯升高。DNA-PKcs是參與DNA損傷的修復(fù)過(guò)程的重要酶類，抑制DNA-PKcs可提高放療敏感性[19]。有研究發(fā)現(xiàn)Zic2依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控由DNA依賴蛋白激酶（DNA-PK）、多聚ADP核糖聚合酶（poly-ADPribosepolymerase，PARP）、RNA解旋酶A（RHA）介導(dǎo)，而DNA-PK 由 Ku70、Ku80以及DNA-PKcs（DNA-PK 的催化亞基）3個(gè)亞基組成[20]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA以抑制CNE2細(xì)胞中Zic2的表達(dá)，平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Zic2表達(dá)后明顯提高CNE2細(xì)胞的放射敏感性，放射增敏比為1.483，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示照射2 Gy后，抑制Zic2表達(dá)的CNE2細(xì)胞的存活率低于陰性對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明Zic2可影響鼻咽癌CNE2細(xì)胞的放射敏感性。本研究利用大劑量X射線反復(fù)照射CNE2細(xì)胞篩選出放射抵抗亞克隆CNE2-R以及予6 Gy劑量的X射線照射CNE2細(xì)胞，通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn)放射抵抗性細(xì)胞CNE2-R及經(jīng)照射后24 h的CNE2細(xì)胞高表達(dá)Zic2，該結(jié)果提示Zic2在放射抵抗細(xì)胞生存中及在DNA損傷的修復(fù)過(guò)程可能起一定作用。因此可推測(cè)鼻咽癌放療后引起DNA損傷導(dǎo)致DNA-PK和PARP活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)了Zic2依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)一步增強(qiáng)了Zic2相關(guān)的促癌的作用從而產(chǎn)生抵抗電離輻射的損傷。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究通過(guò)回顧性分析60例接受放療的宮頸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOXA10蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與放療后宮頸癌患者差的預(yù)后相關(guān)[21]，而已有研究表明HOXA 10通過(guò)誘導(dǎo)Zic 2表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲，因此推測(cè)HOXA10-Zic2亦可能是導(dǎo)致鼻咽癌產(chǎn)生放射抵抗的機(jī)制。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了抑制Zic2表達(dá)可增強(qiáng)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的放射敏感性及對(duì)順鉑的敏感性，放射抵抗性鼻咽癌細(xì)胞株CNE2-R高表達(dá)Zic2，這些結(jié)果提示Zic2可能增加鼻咽癌CNE2細(xì)胞的放化療抵抗性。Zic2可能是預(yù)測(cè)鼻咽癌放化療的內(nèi)在生物標(biāo)志物，為今后制訂鼻咽癌的個(gè)體化治療方案提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究首次驗(yàn)證了抑制Zic2表達(dá)與可增加CNE2細(xì)胞的放射和對(duì)順鉑敏感性的關(guān)系，但本研究尚未驗(yàn)證鼻咽癌細(xì)胞Zic2表達(dá)改變后表達(dá)譜的改變，相關(guān)作用機(jī)制亦尚未明確，將利用高通量基因芯片和蛋白芯片分析鼻咽癌細(xì)胞Zic2表達(dá)改變后表達(dá)譜變化，篩選出靶分子以研究其下游通路，進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定靶蛋白的功能。本研究?jī)H局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，未開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及在鼻咽癌組織中分析Zic2表達(dá)情況，Zic2與預(yù)后關(guān)系仍未知。本研究將進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及在鼻咽癌組織中、與預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，為Zic2相關(guān)的鼻咽癌研究提高新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。