干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX8在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

陳志鵬 李歡 陳樹偉 石丁波 宋明

1華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心（廣州510060）；中山大學(xué)腫瘤防治中心2頭頸科，3ICU（廣州510060）

口腔癌是組織學(xué)上來源于口腔黏膜上皮的惡性腫瘤，以鱗狀細(xì)胞癌最多見，舌為最好發(fā)的亞解剖部位。2018年全球口腔惡性腫瘤新發(fā)病例35.5萬、死亡17.7萬例[1]。我國口腔癌發(fā)病率約2.2/10萬，2015年新發(fā)病例4.8萬、病死病例2.2萬[2]。口腔鱗癌的發(fā)病與煙草、酒精、咀嚼檳榔有關(guān)，在華南高發(fā)地區(qū)是不容忽視的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。早期的口腔鱗癌通過手術(shù)可以取得滿意的根治切除，而存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者需要接受放化療，遠(yuǎn)期預(yù)后較差。并且在產(chǎn)生對(duì)放化療的抵抗后，口腔鱗癌的療效還將大打折扣。腫瘤干細(xì)胞是影響治療敏感性的重要原因[3]。在分子生物學(xué)水平，識(shí)別腫瘤的干細(xì)胞特征標(biāo)志物，仍是目前口腔鱗癌等頭頸部腫瘤研究的重點(diǎn)[4]。

SOX（SRY-related HMG-box）轉(zhuǎn)錄因子家族在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中起重要調(diào)控作用[5]。該類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)異常，則可導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，與腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞性密切相關(guān)[6-9]。目前仍未有關(guān)注口腔鱗癌中SOX8表達(dá)水平和臨床意義的報(bào)道。本研究通過免疫組化方法，先行研究SOX8蛋白在口腔鱗癌的表達(dá)情況，并分析SOX8表達(dá)的臨床意義，為進(jìn)一步探究干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX8在口腔鱗癌的具體作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析了2007年1月至2013年12月中山大學(xué)腫瘤防治中心診治并經(jīng)組織病理確診的口腔癌患者。為進(jìn)行組織中SOX8蛋白表達(dá)檢測(cè)，入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理確診口腔鱗狀細(xì)胞癌；（2）石蠟標(biāo)本保存完好，具有足夠組織量；（3）初治時(shí)不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在、不伴第二原發(fā)癌；（4）標(biāo)本使用通過本單位倫理委員會(huì)審批。研究不涉及病例的個(gè)人隱私，獲準(zhǔn)豁免知情同意。研究共納入68例病例。病例年齡介于34～89歲（中位年齡59歲），男51例、女16例，Ⅰ期11例、Ⅱ期19例、Ⅲ期16例、Ⅳ期21例。

1.2 免疫組化福爾馬林固定-石蠟包埋病理組織均保存于中山大學(xué)腫瘤防治中心生物標(biāo)本庫。檢索調(diào)取組織后，采用免疫組化方法檢測(cè)SOX8蛋白表達(dá)情況。組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化——EDTA溶液微波加熱修復(fù)抗原——3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶——血清封閉非特異位點(diǎn)、SOX8抗體（1∶50）4℃孵育過夜——二抗孵育——DAB顯色——蘇木素復(fù)染，陰性對(duì)照僅使用兔血清。顯微鏡下對(duì)切片拍照并進(jìn)行SOX8染色強(qiáng)度評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。χ2檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)資料兩種分類之間表達(dá)強(qiáng)度、比率的比較。Kaplan-Meier方法用于生存分析及繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)用于預(yù)后的比較。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOX8蛋白在口腔鱗癌腫瘤組織、癌旁組織中表達(dá)情況癌組織中SOX8染色面積大、著色程度強(qiáng)、主要為細(xì)胞質(zhì)著色，高表達(dá)SOX8者占74.6%（50/67）。癌旁組織中僅 15.9%（7/44）高表達(dá)SOX8，且僅1例癌旁組織染色為棕褐色（深著色），其余為淺到中等強(qiáng)度著色以及6例無著色（圖1）。統(tǒng)計(jì)免疫組化結(jié)果顯示，口腔鱗癌中SOX8表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.001，表1）。

圖1 口腔鱗癌組織、癌旁組織中SOX8的表達(dá)（×10，放大部分×200）Fig.1 The expression of SOX8 in oral squamous cell carcinoma tissues and corresponding adjacent normal tongue tissues by immunohistochemistry analysis（×10，magnifiedarea×200）

2.2 SOX8表達(dá)的臨床病理意義結(jié)合病例信息，分析口腔鱗癌中SOX8表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。口腔鱗癌中SOX8的表達(dá)水平與腫瘤原發(fā)灶大小、鱗癌分化程度以及復(fù)發(fā)有關(guān)。T3～T4期腫瘤直徑更大、侵襲更廣泛，SOX8的表達(dá)水平更高（P=0.017）。鱗癌的分化程度越低，惡性度越高，SOX8表達(dá)水平越高（P=0.019）。SOX8表達(dá)與口腔鱗癌是否復(fù)發(fā)有關(guān)，本研究中存在31例局部或遠(yuǎn)位復(fù)發(fā)病例，其中87.1%高表達(dá)SOX8，與低表達(dá)者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）。在口腔鱗癌高危因素中，吸煙、飲酒的患者SOX8高表達(dá)的比例均較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.050，P=0.078）。而SOX8的表達(dá)水平與患者性別、年齡、淋巴結(jié)N分期、是否有咀嚼檳榔史無相關(guān)性。

表1 口腔鱗癌組織、癌旁組織中SOX8的表達(dá)Tab.1 The statistics of SOX8 expression in oral squamous cell carcinoma tissues and corresponding adjacent normal tongue tissues 例

表2 SOX8的表達(dá)與口腔鱗癌臨床病理因素的相關(guān)性Tab.2 Association of SOX8 expression and patient′s clinicopathological features in OSCC.case（percentage）例（%）

2.3 SOX8高表達(dá)的口腔鱗癌患者預(yù)后不良Kaplan-Meier法分析患者總生存率，生存曲線顯示SOX高表達(dá)患者較低表達(dá)患者預(yù)后差，Log-rank檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 SOX8不同表達(dá)的患者生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier analysis of overall survival of OSCC patients with different SOX8 expression（P＜ 0.05，Log-rank test）

3 討論

口腔鱗癌在華南地區(qū)發(fā)病率較高，臨床上采取外科手術(shù)為主的綜合治療。目前新的治療手段如免疫檢查點(diǎn)抑制劑在大多數(shù)頭頸部鱗癌中的應(yīng)用非常有限[10]。晚期病例仍以放化療為主，腫瘤一旦進(jìn)展或復(fù)發(fā)，對(duì)治療產(chǎn)生抵抗后更難以取得滿意療效。腫瘤干細(xì)胞是影響治療敏感性的重要原因[3]。部分口腔鱗癌也會(huì)發(fā)展出對(duì)化療藥物順鉑的抵抗[11]，進(jìn)而轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，影響患者生存。因此研究口腔鱗癌惡性進(jìn)展及復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，具有臨床意義。

筆者在口腔鱗癌及癌旁組織中通過免疫組化檢測(cè)了SOX8的表達(dá)。口腔鱗癌組織上SOX8高表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。SOX8弱表達(dá)的癌旁組織中，染色部位多位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。SOX8表達(dá)越高，組織學(xué)分化程度越低，侵襲越廣泛（T3-T4期），總體而言SOX8高表達(dá)的口腔鱗癌惡性程度高。并且SOX8高表達(dá)患者臨床復(fù)發(fā)率高，且總生存率低，SOX8與患者的不良預(yù)后存在相關(guān)性。

在肺癌[12]、乳腺癌[13-14]等腫瘤中，均有報(bào)道SOX家族作為腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子與其他轉(zhuǎn)錄因子、microRNAs之間形成通路，調(diào)控腫瘤干細(xì)胞性的研究[5]。最早SOX家族研究聚焦在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育、干細(xì)胞誘導(dǎo)等領(lǐng)域[15]。其后也有報(bào)道SOX2調(diào)控舌鱗癌的干性，與患者不良預(yù)后有關(guān)，可被MTA3負(fù)調(diào)控[16]。而SOX-E亞家族（SOX8/SOX9/SOX10）中研究較早的SOX9和Slug可以共同維持乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)[7]；敲除SOX9基因后，化療抵抗的腫瘤細(xì)胞生長被抑制，腫瘤干性標(biāo)志物ALDH1A3和Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)活性降低[17-18]。LARSIMONT等在乳腺癌中通過ChIP-seq發(fā)現(xiàn)SOX9直接與TCF4和LRP6啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[18]。可見SOX9調(diào)控干性的機(jī)制研究開展已比較深入，包括頭頸鱗癌中：miR145通過旁分泌靶向抑制SOX9/ADAM17軸，下調(diào)頭頸鱗癌腫瘤干性[8]，SOX9高表達(dá)的喉鱗癌相應(yīng)的細(xì)胞周期S期比例更高[20]。而同源基因SOX8的研究關(guān)注較少，最近TANG等[9]在三陰乳腺癌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1-SOX8信號(hào)軸參與維持三陰乳腺癌的腫瘤干性。目前仍未有關(guān)注口腔鱗癌中SOX8表達(dá)水平和臨床意義的報(bào)道。

調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄因子等元件位于細(xì)胞核基因上，本研究的免疫組化結(jié)果顯示SOX8在弱表達(dá)的癌旁正常組織中多位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，而在口腔鱗癌組織上SOX8主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。SOX8在細(xì)胞內(nèi)的亞定位可能提示SOX8蛋白與細(xì)胞質(zhì)其他因子之間存在相互關(guān)系。SOX8與臨床病理特征的相關(guān)性，也佐證了其促進(jìn)腫瘤的惡性表現(xiàn)。與低表達(dá)SOX8的口腔鱗癌相比，高表達(dá)SOX8者：總生存率預(yù)后較差，原發(fā)腫瘤直徑大、侵襲更廣泛（T3-T4期），分化程度低，臨床復(fù)發(fā)率高。而SOX8表達(dá)高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM總分期無關(guān)，可能其更傾向于影響癌細(xì)胞的侵襲性，而非轉(zhuǎn)移性。限于本研究納入病例數(shù)量，未能分析遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與SOX8的相關(guān)性。同時(shí)，口腔鱗癌患者性別、年齡、煙酒檳榔等高危因素也與SOX8的表達(dá)水平無關(guān)。

綜上所述，口腔鱗癌中干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX8高表達(dá)，可視為口腔鱗癌預(yù)后不良的標(biāo)志，并與腫瘤T分期高（T3～T4）、病理分化程度低、復(fù)發(fā)率高等臨床病理特征有關(guān)。SOX8高表達(dá)的口腔鱗癌患者總生存率預(yù)后差。