煙草青枯病菌噬菌體分離及其生物學特性研究

胡蓉花，余成鵬，任敏華，李小勇，劉瓊光 ，4

（1.江西省吉安煙草公司，江西 吉安 343000；2.華南農業大學農學院，廣東 廣州 510642；3.江西省峽江煙草公司，江西 峽江 331400；4.廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】煙草青枯病又稱“煙瘟”，是煙草生產上的毀滅性病害，在我國廣東、廣西、云南、湖南、江西、福建、浙江等南方煙草種植區普遍發生[1]。目前，防治煙草青枯病的主要措施包括種植抗性品種、化學藥劑、合理輪作、拮抗菌劑、栽培管理等[2-5]。但在煙葉生產中，這些措施有時并不能有效地控制煙草青枯病的發生，而且化學農藥和抗生素的使用會導致環境污染和病菌抗藥性的產生。研究和開發煙草青枯病防控策略和防治方法的新途徑顯得非常重要，篩選青枯病菌噬菌體，為將來作物青枯病的防治提供噬菌體資源。【前人研究進展】作物青枯病的生物防治，受到國內外廣泛關注，并有大量的文獻報道。其主要利用無致病力青枯菌株、芽孢桿菌（Bacillusspp.）、假單胞菌（Pseudomonasspp.）、鏈霉菌（Streptomycesspp.）等細菌、某些有益真菌、植物分泌物等[4-7]，但在煙葉生產中，實際應用的較少，并且防治效果不穩定。隨著人們對環境和農產品安全要求的提高，青枯病的防控迫切需要一種有效和安全的方法和措施。噬菌體是侵染細菌的病毒，只要有細菌存在的地方就可能出現噬菌體的身影。尤其是作為微生物大本營的土壤，蘊藏著豐富的噬菌體資源[8]。由于噬菌體能有效地感染對其敏感的宿主（或寄主），具有高度的特異性及快速裂解宿主（或寄主）的能力，而對其他菌群不會有破壞作用，因此噬菌體療法有望替代傳統藥物療法[9]，可用于動物和人體細菌疾病的治療[10-13]。此外，利用噬菌體防治植物細菌性病害，也已受到國內外廣泛關注，且有相關文獻報道，例如，在國外利用噬菌體防治由Pseudomonas syringaepv.tomato引起的番茄細菌性葉斑病[14]，利用噬菌體防治由Xanthomonas citrisubsp.citri引起的柑橘潰瘍病[15]和由Pectobacterium carotovorasubsp.carotovora引起的馬鈴薯軟腐病[16]以及由Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病[17-18]等。盡管如此，生產上利用噬菌體防治煙草青枯病尚未有成熟產品。關于使用噬菌體控制煙草青枯菌的報道仍然較少，僅有幾個可以感染煙草青枯菌的噬菌體被分離鑒定的研究[19-21]。

【本研究切入點】由于青枯菌種群多樣性豐富，分離和篩選適合當地青枯病防治的噬菌體，將為利用噬菌體防控煙草青枯病提供噬菌體資源。此外，明確不同溫度、不同酸堿度和不同化學物質對噬菌體的影響，對于進一步開發噬菌體劑型及噬菌體施用方法和技術，具有重要的參考價值和指導意義。【擬解決的關鍵問題】從種植煙草的土壤環境中，通過雙層平板分離，獲得高效價和裂解能力強的噬菌體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試培養基：三倍濃縮液培養基：牛肉膏9 g，酵母膏9 g，蛋白胨9 g，硫酸鎂0.75 g，磷酸氫二鉀6 g，磷酸二氫鉀0.15 g，蔗糖60 g，蒸餾水1000 mL。固體培養基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蔗糖15 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。

半固體培養基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蔗糖15 g，瓊脂8 g，蒸餾水1 000 mL。LB液體培養基：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，加水至1 000 mL。

宿主菌為煙草青枯菌Tb574、Tb7-1、Tb1521、Tb1553、Tb1556，菌株分離自江西省煙區各地，保存于華南農業大學植物細菌研究室。2017年5月，采集江西省吉安市煙區土壤。2017年5月～2018年12月，在華南農業大學植物細菌實驗室完成噬菌體分離、純化和生物學特性研究。

1.2 土壤噬菌體分離

稱取100 g土壤于錐形瓶中，加250 mL水制成土壤懸浮液，靜置30 min，取50 mL上清液，5 000 r/min離心5 min，取上清液與三倍濃縮液培養基以2∶1混合，加入煙草青枯菌（宿主菌），30℃ 180 r/min搖床培養24 h，10 000 r/min離心10 min，上清液經細菌過濾器（25 μm）過濾后，取800 μL與400 μL宿主菌混勻, 隨即加入10 mL約50 ℃的半固體培養基，迅速混勻，倒入固體培養基平板上，制成雙層平板，30 ℃培養24 h。

1.3 噬菌體純化

噬菌體培養：在15 mL LB液體培養基中，加入500 μL宿主菌，接種單個噬菌斑，混勻，30 ℃180 r/min培養過夜。

雙層平板制備：取噬菌體培養液10 000 r/min離心10 min，上清液用LB液體培養基進行連續10倍梯度稀釋，取800 μL稀釋液與400 μL宿主菌液混勻，并加入50 ℃半固體培養基，迅速混勻倒入固體培養基平板上，制成雙層平板，30 ℃培養24 h。

重復上述步驟4～5次，獲得純噬菌體。

1.4 溫度對噬菌體的影響

將噬菌體進行10倍梯度稀釋，在30～80 ℃下，每5 ℃設置溫度梯度，處理30 min，重復3次，將處理后的噬菌體稀釋液制成雙層平板，30 ℃培養24 h。對各雙層平板噬菌斑進行計數，計算每毫升有效噬菌體數量（PFU/mL），計算公式為：PFU/mL=5/4×噬菌斑平均數×稀釋倍數。

1.5 pH對噬菌體的影響

取100 μL噬菌體，分別加入pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等 不 同 pH 各 900 μL LB處理1 h，3次重復。用連續10倍梯度稀釋對處理液進行稀釋，制成雙層平板于30 ℃培養箱培養24 h。

1.6 紫外光對噬菌體的影響

將噬菌體置于敞開玻璃皿中，用18 W紫外燈于皿上方約30 cm處直射，分別處理0、1、2、3、6、9、12、15、18、21 min，收集處理液，制成雙層平板，于30 ℃培養24 h，3次重復。

1.7 乙醚、氯仿對噬菌體的影響

參照劉斌等[22]的方法并改進。取100 μL噬菌體，加入850 μL LB液體培養基，并加入50 μL乙醚制成終濃度為5 %的乙醚溶液，取100 μL上清液加900 μL LB液體培養基作為對照。在4 ℃下放置24 h，3 000 r/min離心15 min，取下層液抽打，揮發乙醚，進行10倍梯度稀釋，制作雙層平板，30 ℃培養24 h。3次重復。計算相對存活率：

用上述同樣方法測定氯仿對噬菌體的影響。

2 結果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

從4份來自不同地區的土壤樣品中共分離到6種噬菌體，每份土壤中均可分離到至少1種噬菌體，有的土壤中還可分離到噬菌斑大小明顯不同的噬菌體，分別將其編號為PTb7-1、PTb1521、PTb1553、P1Tb1556、P2Tb1556、PTb574。6種噬菌體在雙層平板上的噬菌斑見圖1。

圖1 6個噬菌體在各自宿主菌培養平板上的噬菌斑Fig.1 Bacteriophage plaques of 6 phages in their respective host plate

2.2 溫度對噬菌體的影響

各噬菌體在不同溫度處理下，其有效噬菌體數量變化見表1。從表1可以看出，6個噬菌體隨著溫度升高其有效數量逐漸下降，各噬菌體最適溫度在35 ℃左右。噬菌體PTb7-1、PTb1574 、PTb1521致死溫度為 55～60 ℃，噬菌體PTb1553、P1Tb1556、P2Tb1556在55 ℃基本失去活性。

2.3 pH對噬菌體的影響

對噬菌體在不同pH培養基中的生長量進行計量，結果（表2）表明，噬菌體PTb7-1隨著pH的升高，有效數量減少，噬菌體PTb574、PTb1521、PTb1553、P1Tb1556、P2Tb1556在 pH 5～9范圍內有較好活性，說明弱酸和弱堿環境對6個噬菌體活性的影響不顯著。

2.4 紫外光對噬菌體的影響

噬菌體經紫外光照射后，觀察記錄在雙層平板上噬菌斑個數，并計算每毫升有效數量。結果（表3）表明，噬菌體在紫外光照射過程中有微弱的數量波動現象，其中噬菌體PTb7-1在紫外光照射21 min后失去活性，其他噬菌體在紫外光照射21 min后均還有一定的活性。噬菌體PTb1553、P2Tb1556隨紫外光照射的時間增長，有效數量下降較慢，對紫外光較為不敏感。

表1 不同溫度處理對6個噬菌體活性的影響Table 1 Effects of different temperature treatments on the activity of 6 phages

表2 不同pH處理對6個噬菌體活性的影響Table 2 Effects of different pH treatments on the activity of 6 phages

表3 紫外光照射對6個噬菌體活性的影響Table 3 Effect of ultraviolet light on the activity of 6 phages

2.5 乙醚、氯仿對噬菌體的影響

對記錄的噬菌斑數進行有效噬菌體數量計算，分別計算乙醚、氯仿處理后的相對存活率。結果（表4）表明，除噬菌體P2Tb1556外，均受乙醚抑制作用，而噬菌體P2Tb1556對乙醚不敏感，甚至還有促進活性的作用。6個噬菌體對氯仿的敏感程度由強到弱為：PTb7-1＞PTb1521＞PTb1553＞ P1Tb1556 ＞ PTb574 ＞ P2Tb1556。用氯仿處理后，噬菌體P2Tb1556最敏感，噬菌體PTb574、PTb152表現不太敏感，6個噬菌體對氯仿的敏感程度由強到弱為：P2Tb1556＞P1Tb1556＞PTb1553＞ PTb7-1＞PTb574＞PTb1521。

表4 6個噬菌體經氯仿、乙醚處理后的相對存活率Table 4 The relative survival rates of 6 phages treated with chloroform and ether (%)

3 討論

從煙草青枯病發病的土壤中，采用雙層平板法分離出6個青枯菌噬菌體，說明煙田土壤中有豐富的青枯菌噬菌體資源[23]。青枯菌是一種土壤習居菌，可長時間存活于土壤中，特別是在發病土壤中存活數量更大，因此，篩選防治作物青枯病的噬菌體資源可以直接從土壤中分離獲得。此外，本研究還發現，同一土壤樣品中可分離得到兩種噬菌斑大小完全不同的青枯菌噬菌體，表明同一土壤中可存在多種青枯菌噬菌體，土壤中蘊藏著豐富的噬菌體資源[8]，這為大量篩選不同青枯菌噬菌體提供了可能。

不同噬菌體生物學特性不同，研究噬菌體的生物學特性是應用噬菌體治療細菌病害的基礎。本試驗通過物理、化學因素對噬菌體生長影響的比較研究，發現不同噬菌體受其影響程度不同。

在溫度試驗中，多個噬菌體的最適溫度為35 ℃左右，致死溫度為55～60 ℃，這與Cai等[21]結果相似，而與Bae等[24]報道的噬菌體PE204在溫度15～60 ℃范圍內穩定有區別。通常煙草青枯菌最適溫度為30～35 ℃，致死溫度為52℃[5]，在實際應用中可以利用噬菌體活性溫度和青枯菌的致死溫度來處理噬菌體培養液，以消除青枯菌的污染，為噬菌體制劑的研制提供有價值的參考。

在不同pH值條件下，噬菌體PTb7-1數量隨著pH的上升而下降，說明該噬菌體可能更適合在酸性條件下生存。所有噬菌體在不同pH下有數量波動現象，可能與蛋白質的結構有關，還需進一步研究。大多數噬菌體在pH 5～9條件下能較好生長，由此說明利用這些噬菌體防治作物青枯病，其田間應用不會受到環境酸堿度的影響，這與高苗等[19]研究結果有差異，原因可能是由于噬菌體的種類不同或者不同地域環境因素導致不同噬菌體的生物學特性存在差異。

克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）噬菌體在紫外光下產生波動的現象，是由噬菌體蛋白質對紫外光產生抗性的結果[22]。本研究結果發現，噬菌體隨著紫外光處理時間的延長，其數量出現波動現象，紫外光照射21 min后，噬菌體PTb7-1存活率極低，而其他5個噬菌體還保留有較好的活性。高苗等[19]測定的青枯菌噬菌體在紫外光照射21 min后，失去活性，推測不同噬菌體對紫外光的敏感性不同。在本研究中，噬菌體PTb1553、P2Tb1556對紫外光抗性較好，該特性在噬菌體制劑的研發和使用技術上，將具有實際意義。

乙醚、氯仿敏感性試驗結果表明，噬菌體PTb7-1、PTb574、PTb1521、PTb1553、P1Tb1556對乙醚、氯仿敏感，其敏感程度有差異。噬菌體P2Tb1556對乙醚不敏感，乙醚處理后相對存活率高于100%，但對氯仿敏感，這對指導噬菌體制劑與有機無機化合物的混配具有參考價值。

4 結論

利用噬菌體防控煙草青枯病必需獲得噬菌體資源。從發生有青枯病的煙草土壤中可以直接分離到青枯菌噬菌體，土壤中具有豐富的噬菌體資源。從江西省吉安市煙田土壤中分離得到的6個青枯菌噬菌體的最適生長溫度約為35 ℃，致死溫度為55～60 ℃，適宜酸堿度為pH 5～9，且對紫外光、乙醚和氯仿敏感。噬菌體PTb7-1只適合于酸性環境，噬菌體P2Tb1556對紫外光和乙醚不敏感，但對氯仿敏感。