青稞種子萌動過程中抗氧化活性的變化

白永亮，凌志洲，陳甜妹，曾 榮，夏 雨，吳俏槿 ，劉靄莎

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；3.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東 中山 528437）

【研究意義】青稞（Hordeum vulgareL.var.nudum hook.f.）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，富含β-葡聚糖、多酚類化合物、黃酮和γ-氨基丁酸（GABA）等重要生物活性成分[1]，具有抗氧化、調節免疫系統、抗糖尿病等重大生理作用[2-5]，且萌動后的青稞抗氧化活性及抑癌防癌作用均明顯高于未經萌動處理的青稞[6-7]。此外，青稞還含有能清除體內自由基、延緩衰老的超氧化物歧化酶（SOD）[8]，有激活腦內葡萄糖代謝、促進乙酰膽堿合成、降血氮、降血壓等生理功能[9-11]。目前青稞的應用仍然停留在較基礎的層次上，如青稞粉、青稞面和青稞烘焙等產品，對于青稞的深加工利用和經濟發展造成了一定的局限性[12]。

【前人研究進展】楊希娟等[13]研究發現青稞酚類化合物含量與粒色有關，黑色粒色酚類化合物含量最高，且自由基清除能力的強弱與酚類物質的形態結構相關；張帥等[14]研究了不同粒色青稞營養品質與抗氧化活性的差異，結果表明彩色青稞的營養物質和抗氧化活性物質含量均優于白色青稞，證明抗氧化活性與青稞的粒色相關；邢玉曉[15]研究了不同品種青稞的抗氧化活性及其作用，表明青稞的抗氧化活性非單一，而是多種有效物質綜合發揮作用的結果。青稞抗氧化成分的研究主要集中在多糖、酚類、花青素、紫色素等方面[16-19]，而有關青稞經萌動處理后抗氧化活性的研究較少?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，通過萌動改善青稞食用品質和營養價值成為研究熱點[20-22]。谷物萌動后蛋白酶等水解酶系活性被激活，導致α-淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、β-葡聚糖酶等酶活力提高，促進了谷物中營養和功能性組分含量的改變[23]。谷物在萌動過程中胚乳細胞壁破裂導致胚乳內儲存的物質降解，為胚軸生長提供營養和供能，這種變化一定程度上降解和消除了抗營養物質，并增加了對人體有益的物質如GABA和生育酚等，同時使得營養物質更有利于人體吸收[24]。目前關于青稞萌動后在抗氧化活性方面的研究較少，主要集中在品種間青稞酚類化合物種類、含量及抗氧化活性差異等方面?！緮M解決的關鍵問題】基于青稞的抗氧化活性，研究青稞浸麥和萌芽過程中總酚、黃酮、GABA和β-葡聚糖含量的變化規律，探究其與抗氧化活性的相關性，為青稞功能性產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青稞（藏青2000）產于西藏林芝地區工布江達縣巴河鎮甲熱村，干麥芽、干谷芽、干稻芽購于安徽毫州。

GABA標準品，HPLC≥99%，購于上海金穗生物科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（FDNB），純度≥98%，購于上海麥克林科技有限公司；蘆丁標準品，純度≥98%，購于上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、FoLin酚試劑等，均為分析純，購于廣東光華科技股份有限公司。

1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，購于安捷倫科技（中國）有限公司；LHS-150/250HC-Ⅱ恒溫恒濕培養箱，購于上海一恒科學儀器有限公司；752紫外可見分光光度計，購于上?，F科分光儀器有限公司；Dura pro 12超純水系統，購于澤拉布儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗方法

將青稞種子用0.85 mm篩網篩選，去除雜物和石子，挑選生理狀態良好、沒有破損、顆粒飽滿的青稞籽粒，用清水反復沖洗干凈，再用2%的次氯酸鈉在室溫下浸泡15 min后用無菌水洗滌4～5次。（1）浸麥時間的影響：將處理好的青稞在15℃下按照浸4斷2方式（浸麥4 h-空氣休止2 h，蒸餾水）設5個萌動處理，分別浸麥0、6、12、18、24 h，然后在25 ℃、濕度90%、光照強度7 500 lx下萌動48 h。（2）萌芽時間的影響：將處理好的青稞在15 ℃下按照浸4斷2方式浸麥處理24 h后，在25 ℃、濕度90%、光照強度7 500 lx下，設 7個處理分別萌動0、8、16、24、32、40、48 h。萌動后將青稞芽經真空冷凍干燥，分別測定浸麥、萌芽過程中4種功能性成分含量的變化，重復3次。

將青稞芽（15 ℃浸麥24 h，25 ℃、濕度90%、光照強度7 500 lx下萌芽48 h制備）、麥芽、谷芽和稻芽經真空冷凍干燥，然后粉碎過0.180 mm篩，以料液比1∶10、50 ℃蒸餾水稀釋，攪拌均勻，超聲波提取10 min，再經50 ℃水浴鍋中提取5 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液備用。按照0.025、0.033、0.050、0.010 mg/L濃度梯度分別配制4種芽提取液，待測。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 GABA 采用高效液相色譜法測定，結合段智紅等[25]的方法稍作改動。衍生劑為1% 2,4-二硝基氟苯（FDNB）乙腈溶液；流動相由A、B雙組分組成，A流動相為pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，B流動相為V（CH3CN）∶V（H2O）=1∶1；柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長360 nm，梯度洗脫方法見表1。所得標曲為Y=211.29X-0.3446（R2=0.9992）。

表1 GABA流動相洗脫梯度Table 1 GABA mobile phase elution gradient

1.3.2 總酚含量 采用Folin-Ciocalteu法[26]測定。

1.3.3 黃酮含量 采用硝酸鋁顯色法[27]測定。

1.3.4 β-葡聚糖含量 采用剛果紅法[28]測定。

1.3.5 羥自由基清除率 參考杜道坤等[29]的方法稍作改進。于試管中加入樣品0.5 mL、9.1 mmol/L水楊酸乙醇溶液0.5 mL、9 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，最后再加入8.8 mmol/L H2O25 mL啟動反應；37 ℃水浴反應0.5 h，以蒸餾水作對照，在510 nm處測吸光度，重復3次。計算清除率：

式中，D0（510nm）為空白管吸光度，D1（510nm）為反應溶液吸光度，D2（510nm）為只含H2O2和樣品液對照管的吸光度。

1.3.6 金屬離子還原能力測定 參考袁博等[30]的方法稍作改進。在試管中依次加入pH 6.6磷酸緩沖液2.5 mL、待測樣品1 mL、1%鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻，于50 ℃恒溫條件反應20 min，冷卻；加入10%三氯乙酸2.5 mL反應0.5 h，4 000 r/min離心10 min。取上清液5 mL，加入水5 mL、0.1%三氯化鐵溶液1 mL，混勻靜置10 min。以蒸餾水作對照于700 nm下測定吸光度，重復3次。吸光度越大，表明樣品還原力越強。

1.4 數據分析處理

試驗數據采用Origin 2017SP2和Microsoft Excel 2016進行整理和作圖，采用SPSS19.0進行方差分析和多重比較，相關性分析使用Pearson雙側檢驗。

2 結果與分析

2.1 青稞浸麥過程中活性成分和抗氧化活性的變化

圖1 浸麥時間對青稞黃酮及總酚含量的影響Fig.1 Effect of soaking time on the contents of flavonoids and total phenols in highland barley

圖2 浸麥時間對青稞GABA及β-葡聚糖含量的影響Fig.2 Effect of soaking time on the contents of GABA and β-Glucan in highland barley

圖3 浸麥時間對青稞羥自由基清除率和金屬離子還原能力的影響Fig.3 Effects of soaking time on the hydroxyl free radical clearance rate and reduction capacity of metal ions of highland barley

由圖1、圖2可知，在本試驗條件下，青稞經浸麥萌動后總酚和黃酮含量隨著浸麥時間的延長不斷提高，以黃酮含量增長速率較快；GABA含量隨著浸麥時間的延長呈先上升后平穩的趨勢；β-葡聚糖含量隨浸麥時間延長則緩慢下降。由圖3可知，青稞經浸麥萌動處理后對羥自由基的清除率在浸麥6 h達到最大值（64.88%），在浸麥18 h逐漸趨于穩定；青稞對金屬離子還原能力在浸麥6 h達到最大（0.91），之后開始出現明顯下降趨勢。

2.2 青稞萌芽過程中活性成分和抗氧化活性的變化

圖4 萌芽時間對青稞黃酮及總酚含量的影響Fig.4 Effect of germination time on the contents of flavonoids and total phenols in highland barley

圖5 萌芽時間對青稞GABA及β-葡聚糖含量的影響Fig.5 Effect of germination time on the contents of GABA and β-Glucan in highland barley

圖6 萌芽時間對青稞羥自由基清除率和金屬離子還原能力的影響Fig.6 Effects of germination time on the hydroxyl free radical clearance rate and reduction capacity of metal ions of highland barley

由圖4可知，青稞萌動后總酚和黃酮含量均隨萌芽時間的延長呈現先上升后下降的趨勢。與浸麥萌動相比，總酚和黃酮含量在萌芽初始階段上升速率較快，總酚含量在萌芽40 h達到最高為2.584 mg/g，黃酮含量在萌芽32 h達到最大為2.306 mg/g。由圖5可知，與浸麥階段相比，GABA含量在萌芽過程中上升速率顯著提高，β-葡聚糖含量進一步下降。由圖6可知，隨著萌芽時間的延長，萌動青稞對羥自由基的清除率和金屬離子還原能力均呈先升高后降低的趨勢，其中羥自由基的清除率在萌芽8 h達到最高值71.23%，對金屬離子還原能力也在萌芽8 h達到最大值。

2.3 功能性成分與抗氧化活性的相關性分析

由表2的相關性分析可知，與萌芽階段相比，總酚在浸麥階段與抗氧化活性相關性較強，但不顯著。原因可能是由于青稞體外抗氧化活性與總酚含量相關，但同時也存在其他成分對抗氧化活性的貢獻，且各功能性成分之間可能存在相互影響。本研究結果表明，青稞浸麥和萌芽過程中黃酮含量與抗氧化活性均無顯著相關性，但萌芽階段的相關性比浸麥階段高，這可能受到其他未測定的抗氧化成分的影響，也可能與物質之間的協同作用機制有關。與萌芽階段相比，GABA在浸麥階段與抗氧化活性的相關性較高，且顯著相關，說明浸麥時間對提高青稞抗氧化活性具有顯著影響。β-葡聚糖在浸麥及萌芽過程中均呈負相關，但不顯著。

表2 青稞功能性成分與抗氧化活性的相關性分析Table 2 Correlation analysis of functional components and antioxidant activity of highland barley

2.4 青稞芽、麥芽、谷芽和稻芽之間的抗氧化活性比較

由圖7、圖8可知，4種谷物芽的抗氧化活性隨著樣品濃度的升高而增強，在一定濃度范圍內，麥芽對羥自由基清除率最強，其次是青稞芽和谷芽，稻芽最差；各谷物芽對金屬離子還原能力強弱表現為麥芽＞稻芽＞谷芽＞青稞芽。不同谷物芽在羥自由基清除能力和金屬離子還原能力上體現出不同的結果，可能與谷物中所含黃酮、酚類等物質的形態、結構及含量差別有關。不同形態酚類及黃酮類物質對清除自由基及金屬離子還原能力的強弱具有選擇性，青稞芽的抗氧化活性受游離態及結合態酚類等化合物含量的共同影響[13,31]。

圖7 4種谷物芽粉對羥自由基清除率的影響Fig.7 Effects of four kinds of cereal bud powders on hydroxyl free radical clearance rate

圖8 4種谷物芽粉對金屬離子還原能力的影響Fig.8 Effects of four kinds of cereal bud powder on reduction capacity of metal ions

3 討論

種子萌動改性是一種有效改善谷物食用品質和提高其營養價值的方法[6-7]，通過萌動處理可以提高青稞功能性成分的含量及增加其抗氧化活性。青稞浸麥萌動后抗氧化活性得到提高，可能與籽粒吸水膨脹后各種內源酶被激活導致酚類及黃酮類物質含量上升有關，與本研究結果青稞浸麥萌動后酚類、黃酮及GABA含量增加一致。浸麥時間超過6 h，萌動青稞抗氧化活性開始降低，可能與β-葡聚糖等成分的降解有關，青稞籽粒隨浸麥時間延長膨脹度升高，β-葡聚糖酶活性進一步增強，促使β-葡聚糖迅速降解[32]；同時，與多酚氧化酶的活性處于較高水平有關，部分多酚被氧化分解也可能導致青稞抗氧化活性下降。綜上，浸麥萌動處理可以提高青稞的抗氧化活性，可通過選擇適宜的浸麥時間獲得高抗氧化活性青稞芽。

青稞處于萌芽萌動初期，各種酶活不斷提高、生化反應激烈，總酚、黃酮和GABA含量隨著萌芽時間延長而增加?？偡?、黃酮和GABA功能性成分在萌芽前期均存在迅速積累的過程，導致羥自由基清除率不斷上升，其后保持較高的穩定水平[24]。同時，隨著萌芽時間的延長，青稞芽內的能量和物質被不斷消耗，導致抗氧化活性呈現下降趨勢[23]，因此要合理調控青稞萌芽時間，以獲得高抗氧性青稞原料。

研究表明，酚類物質分子因具有強螯合性，能較好地清除人體內的自由基，起到抗氧化、抗衰老的效果[33]。黃酮是一種強抗氧劑，可有效清除體內自由基，具有抗衰老、防癌抑癌、保護心血管、抗心律失常等作用[34]。但本研究結果表明，青稞浸麥及萌芽過程中抗氧化活性與總酚、黃酮含量相關性均不顯著，與韓玲玉等[35]的研究結果相似。原因一方面由于其他活性成分對抗氧化活性的貢獻及存在相互影響，還可能與青稞在不同萌動階段黃酮和多酚的存在形態、組成以及含量差異有關[36]。目前對于GABA的研究主要集中在GABA的富集及生理功能研究方面[37]，未見涉及探討GABA與抗氧化的相關性研究。本試驗結果表明，GABA在青稞浸麥萌動中與抗氧化活性顯著相關，可通過調控浸麥工藝來提高青稞原料的抗氧化活性，其相關影響原理目前尚無定論，仍需進一步研究。

4 結論

青稞種子經萌動處理后可增強抗氧化活性和增加功能性成分含量，總酚、黃酮及GABA在萌動處理后含量均得到提高；抗氧化活性最強的浸麥時間為浸麥萌動6 h，最強的萌芽時間為萌芽萌動8 h。本試驗結果表明，萌動處理可作為一種有效提高青稞抗氧化活性的方法。

相關性分析表明，不同功能性成分在不同萌動階段與抗氧化活性呈現不同的相關性P值。在4種成分中，黃酮在萌芽階段呈現較高的相關性，GABA與浸麥階段抗氧化活性顯著相關。為了更好地評估青稞的抗氧化活性，需進一步采用不同機理的抗氧化評價方法，從不同側面來反映青稞抗氧化活性的水平。

此外，各谷物芽的抗氧化活性均隨樣品濃度的升高而增強，青稞芽與其他3種市售谷物芽產品相比抗氧化活性不具有優勢。因此，進一步研究青稞萌動工藝，通過控制環境變量或其他萌動處理方式來調節萌動過程中多酚、黃酮、β-葡聚糖及GABA等功能性成分的含量，從而提高萌動青稞的抗氧化活性是進一步研究的方向。