右美托咪定對大鼠心肌缺血再灌注損傷程度、炎性因子及Toll 樣受體4/核因子кB 信號通路的影響研究

任小鵬，孫春喜，李建成，高彥霞，潘龍飛

心肌缺血再灌注損傷是心肌組織和細胞缺血后血液復流引起的心肌組織損傷現象［1］，研究表明，多種病理生理機制參與心肌缺血再灌注損傷的發生發展，其中炎性反應與心肌缺血再灌注損傷的關系是近年研究熱點［2］。Toll 樣受體4/核因子κB（TLR4/NF-κB）信號通路在抗炎和細胞凋亡調控過程中均發揮著重要作用［3］。有研究表明，缺血再灌注損傷與TLR4/NF-κB信號通路的激活有關［4］。右美托咪定可通過TLR4/NF-κB 信號通路而調節炎性反應，但其對心肌缺血再灌注損傷保護機制的研究鮮有報道。本研究旨在探討右美托咪定對大鼠心肌缺血再灌注損傷程度、炎性因子、TLR4/NF-κB 信號通路的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 心肌細胞及其培養 2018 年2—12 月，選取大鼠源性H9C2 心肌細胞系，購自中國科學院細胞中心。心肌細胞系于37 ℃、含5%二氧化碳環境下的DMEM 培養基（含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和鏈霉素）中培養，隔天更換培養基，細胞貼壁80%后采用胰蛋白酶消化，取對數生長期狀態良好的心肌細胞，并隨機分為對照組、心肌細胞損傷組、預處理組。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 胎牛血清（Gibco 公司，美國），胰蛋白酶（Sigma 公司，美國），反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒〔生工生物工程（上海）有限公司〕，TLR4 siRNA、TLR4 過表達載體（上海吉瑪制藥技術有限公司），細胞核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），抗NF-κB p65 抗體ab7970（Abcam 公司，英國），抗TLR-4 抗 體sc-10741（Santa Cruz Biotechnology，美國），超敏ECL 發光液（蘇州新賽美生物科技有限公司），PVDF 膜（Millipore 公司，美國），甲基噻唑藍（MTT）比色法試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）（南京建成生物工程研究所）。

1.2.2 主要儀器 光鏡（OLYMPUS BX50，日本），熒光化學發光成像系統（培清生物科技有限公司），低溫離心機（Eppendorf 公司，德國），電泳槽、轉移槽及其配件（Bio-rad 公司，美國），恒溫二氧化碳培養箱（Thermo fisher，美國），離心機（MD spectraMax 190，美國），水浴箱（東臺市躍進電器廠），普通聚合酶鏈反應（PCR）儀（Thermo fisher，美國）。

1.3 方法

1.3.1 對照組 對照組心肌細胞進行常規培養：將心肌細胞于37 ℃、含5%二氧化碳培養箱中培養，1～2 d 傳代1 次，取2～4 代細胞。

1.3.2 心肌細胞損傷組 心肌細胞損傷組心肌細胞建立缺血再灌注損傷模型：將心肌細胞置于適宜濃度種板，細胞融合度在80%～90%時使用4 mmol/L 連二亞硫酸鈉清除培養基內的氧氣導致缺氧1 h，后轉換為正常培養基培養12 h。

1.3.3 預處理組 預處理組心肌細胞先給予右美托咪定（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，國藥準字H20090248）1 μmol/L 預處理1 h，后建立缺血再灌注損傷模型，方法同心肌細胞損傷組。

1.4 觀察指標

1.4.1 心肌細胞形態 將三組心肌細胞分別接種于6孔培養板（2 ml），于37 ℃、含5%二氧化碳環境下DMEM 培養基中培養4 h，使用光鏡（×200）觀察心肌細胞形態學變化。

1.4.2 細胞存活率 三組心肌細胞分別接種于96 孔培養板中，加入5 g/L MTT 溶液20 μl，于37 ℃、5%二氧化碳環境下DMEM 培養基中培養4 h，吸凈培養液后加入DMSO 150 μl，采用酶聯免疫吸附試驗檢測490 nm 處光密度值（OD），各組均重復3 次并取平均值，計算細胞存活率。

1.4.3 炎性因子mRNA 相對表達量 采用RT-PCR 檢測三組心肌細胞腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）mRNA 相對表達量，嚴格按照RT-PCR 試劑盒說明書進行操作。

1.4.3.1 總RNA 提取 調整細胞密度并接種于6 孔板，每組3 個復孔，孵育24 h，按實驗分組進行藥物預處理，建立缺氧/復氧模型，使用PBS 徹底清洗，給予1 ml Trizol 進行消化、裂解5 min，12 000 ×g 離心5 min，按照200 μl 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，室溫放置15 min。4 ℃ 12 000 ×g 離心15 min，取上層水相置于另一離心試管內，按照0.5 ml 異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇，室溫放置15 min。4 ℃ 12 000 ×g 離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇，4 ℃ 8 000 ×g 離心5 min，置于室溫5～10 min。20 μl DEPC H2O 溶解，55～60 ℃，5～10 min。酶標儀檢測260 nm 和280 nm 的OD 及其比值，檢測RNA 濃度和純度，1.9～2.0 表示RNA 純度較高。

1.4.3.2 反轉錄 根據檢測RNA 濃度計算RNA 模板反轉錄的上樣量：模板上樣量=1 000 μg/C，按5×All-In-One RT MasterMix 說明書進行，反應條件：42 ℃，60 min；70 ℃，5 min；4 ℃終止反應。

1.4.3.3 PCR 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成完成。熒光定量PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性5 min，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，80 ℃讀板1 s，共40 個循環后繪制熔解曲線，72 ℃再延伸5 min。

1.4.3.4 目的基因mRNA 相對表達量 內參基因均為β-actin，熒光定量PCR 檢測離心試劑管內熒光強度達到所設定閾值的循環數即CT 值，目的基因的mRNA 相對表達量=2-ΔΔCT×100%；ΔΔCT=目的基因CT 值-內參基因CT 值。

1.4.4 TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量 采用Western blot 法檢測各組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量，具體如下：提取蛋白：使用細胞裂解液充分裂解心肌細胞，采用細胞核蛋白抽提試劑抽提細胞核蛋白，采用BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，后水浴鍋煮，80 ℃，10 min；配置濃縮膠：恒壓80 V，Marker 分層后升至120 V 進行電泳；轉膜：恒流200 mA，時間90～120 min，保持低溫；封閉：PVDF 膜置于5%的脫脂牛奶中進行封閉，搖床70 次/min，室溫封閉2 h 或4 ℃過夜；剪膜+洗膜：根據目的蛋白分子量和Marker 指示將膜剪開，TBST 液洗3 次，15 min/次；孵育Ⅰ抗，室溫4 h 或4 ℃過夜；洗膜后孵育Ⅱ抗，室溫2 h；洗膜后經超敏ECL 發光液處理，采用JS-8608 凝膠成像分析儀分析目的蛋白和內參蛋白。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞形態學 對照組心肌細胞排列整齊，細胞膜表明光滑；心肌細胞損傷組心肌細胞形態不一，存在心肌細胞凋亡、脫落、漂浮現象；預處理組心肌細胞由缺氧-復氧損傷引起的形態學改變減輕，見圖1。

2.2 心肌細胞存活率 對照組心肌細胞存活率為（1.00±0.52）%，心肌細胞損傷組為（0.48±0.09）%，預處理組為（0.67±0.10）。三組心肌細胞存活率比較，差異有統計學意義（F=13.451，P＜0.01）；心肌細胞損傷組、預處理組心肌細胞存活率均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；預處理組心肌細胞存活率高于心肌細胞損傷組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 炎性因子mRNA 的相對表達量 三組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；心肌細胞損傷組、預處理組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對表達量均高于對照組，預處理組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對表達量低于心肌細胞損傷組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）

圖1 光學顯微鏡下三組大鼠心肌細胞形態學變化（標尺100 μm，×200）Figure 1 Morphological changes of cardiomyocytes in the three groups of rats under optical microscope

表1 三組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對表達量比較（x± s）Table 1 Comparison of relative mRNA expression quantity of TNF-α，IL-6 and IL-1β in three groups

2.4 心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量 三組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F 值分別為13.665、18.045，P 值＜0.01）；心肌細胞損傷組、預處理組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量高于對照組，預處理組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量低于心肌細胞損傷組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖2～3）。

3 討論

研究表明，氧自由基釋放增多、鈣超載、心肌細胞凋亡、炎性反應、心肌細胞能量代謝障礙等均參與心肌缺血再灌注損傷的發生發展［5-7］。TLR4 是參與機體固有免疫的主要特異性受體，能夠識別革蘭陰性菌脂多糖（LPS）誘導的細胞信號傳導通路，從而上調炎性因子表達。研究表明，心肌細胞膜上廣泛存在TLR4，并與心肌細胞功能相關［8］。有動物實驗表明，敲除小鼠心肌細胞上TLR4 基因后缺血再灌注損傷所致炎性反應明顯減輕［9］，提示心肌細胞膜上TLR4 受體與心肌缺血再灌注損傷有關。右美托咪定為腎上腺素受體激動劑，其能夠減輕內毒素誘導的炎癥，分析其原因可能與下調TLR4/NF-κB 信號通路有關［10］。

圖2 三組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白電泳結果Figure 2 Protein electrophoresis results of TLR4 and NF-κB in the three groups

圖3 三組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量比較Figure 3 Comparison of relative protein expression quantity of TLR4 and NF-κB in the three groups

XU 等［11］研究表明，缺氧-復氧會降低大鼠心肌細胞存活率。本研究結果顯示，心肌細胞損傷組、預處理組心肌細胞存活率低于對照組，提示經缺血再灌注后心肌細胞損傷程度加重。但本研究結果顯示，預處理組心肌細胞由于缺氧-復氧損傷引起的形態學改變減輕，且預處理組心肌細胞存活率高于心肌細胞損傷組，提示右美托咪定能減輕缺血再灌注后心肌細胞損傷程度。

TNF-α、IL-6、IL-1β 均是缺血再灌注損傷過程中的重要炎性因子，其中TNF-α 能促使炎性細胞向缺血區浸潤［11］；IL-6 在炎性反應中具有調控作用，其能加重機體炎性損傷程度［12］；IL-1β 具有誘導中性粒細胞黏附和聚集等作用［13］。多項研究結果表明，TNF-α、IL-6、IL-1β 參與急性心肌梗死、缺血再灌注損傷等［14-15］，分析其原因可能與參與多種信號傳導通路如GPR37/JNK/PPAR-γ、TLR4/NF-κB 信號通路有關［16-17］。本研究結果顯示，心肌細胞損傷組、預處理組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對表達量高于對照組，預處理組心肌細胞TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 相對表達量低于心肌細胞損傷組，提示右美托咪定能有效減輕心肌缺血再灌注損傷過程中炎性反應。本研究結果顯示，心肌細胞損傷組、預處理組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量高于對照組，預處理組心肌細胞TLR4、NF-κB 蛋白相對表達量低于心肌細胞損傷組，提示右美托咪定能通過下調心肌細胞TLR4/NF-κB信號通路而減輕心肌缺血再灌注損傷程度。

綜上所述，右美托咪定能有效改善大鼠缺血再灌注損傷心肌細胞存活率，減輕炎性反應，其可能通過下調心肌細胞TLR4/NF-κB 信號通路而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷程度。

作者貢獻：任小鵬、潘龍飛進行文章的構思與設計，研究實施與可行性分析，對結果分析與解釋，負責文章的質量控制及審校；孫春喜、李建成進行數據收集及整理；高彥霞進行統計學處理；任小鵬負責撰寫論文并修訂；潘龍飛對文章整體負責，監督管理。

本文無利益了沖突。