多色探針熒光PCR熔解曲線法用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變檢測進行臨床評價

韋洪偉　尹文東

【摘 要】目的：評價分析多色探針熒光PCR熔解曲線法用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥基因突變檢測價值。方法：選取本院（在2014年2月-2015年11月）收治的104例葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患兒（2例女患兒、102例男患兒），按照不同檢測方法分為實驗組（52例，應用多色探針熒光PCR熔解曲線法加以檢測）和對照組（52例，應用G6PD/6PGD定量比值法加以檢測）。以金標準Sanger測序評價多色探針熒光PCR熔解曲線法和G6PD/6PGD定量比值法。采用統計學分析兩組G6PD缺乏癥患兒的靈敏度。結果：實驗組G6PD缺乏癥患兒的靈敏度顯著高于對照組（P<0.05）。結論：多色探針熒光PCR熔解曲線法用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥基因突變檢測價值顯著。

【關鍵詞】多色探針熒光PCR熔解曲線法;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥;基因突變;G6PD/6PGD定量比值法

【中圖分類號】R446【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2020）01-03--01

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是一種常見的紅細胞酶缺陷病，我國南方地區高發葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥。調查研究顯示，女性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者中雜合子比例高[1]。現階段來看，診斷葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的臨床診斷方法有：其一，分子生物學檢測方法;其二，生化檢測方法。生化檢測方法是一種傳統診斷方法，生化檢測方法主要是通過直接或間接測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性來篩查葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者，其中男性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶患者檢出率高，而女性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶患者檢出率較低。分子生物學檢測方法主要有多色探針熒光PCR熔解曲線法，主要利用改良分子探針對PCR產物進行實時分析的突變檢測技術。多色探針熒光PCR熔解曲線法目前已經被廣泛應用在地中海貧血基因檢測以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因檢測。將多色探針熒光PCR熔解曲線法在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥雜合子中的相關應用未見諸多報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院（在2014年2月-2015年11月）收治的104例葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患兒（2例女患兒、102例男患兒），按照不同檢測方法分為實驗組（52例）和對照組（52例）。實驗組中有51例男患兒、1例女患兒;對照組中有51例男患兒、1例女患兒;實驗組平均年齡為（5.2±1.9）歲，對照組平均年齡為（5.4±1.7）歲。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本 按照標準操作采集葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患兒以及家庭成員外周血樣本，采用抗凝劑抗凝治療。

1.2.2 檢測方法 對照組應用G6PD/6PGD定量比值法加以檢測，采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥酶活性測定試劑盒，嚴格按照說明書進行檢測。應用紫外分光光度計測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥光密度值A1和6PGD光密度值A2，計算G6PD/6PGD比值（陰性：≥1;陽性：<1），判斷葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥酶是否缺乏。

實驗組應用多色探針熒光PCR熔解曲線法加以檢測，應用全自動核算提取儀提取外周靜脈血DNA，采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變檢測試劑盒，在每一份樣本中加入25uLDNA到PCR反應體系（包含四色熒光探針），再在PCR檢測儀上檢測，根據樣本與野生型對照溶解峰差異（Tm 值在 ±1℃ 即為野生型峰、突變型峰為超過 ±2℃）判斷葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變。常見葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變類型有：（1）c.1376G>T;（2）c.487G>A;（3）c.1360C>T;（4）c.1024C>T;（5）c.1388G>A;（6）c.871G>A;（7）c.1004C>A;（8）c.592C>T;（9）c.95A>G。

1.2.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因測序 以金標準 Sanger 測序評價多色探針熒光PCR熔解曲線法和G6PD/6PGD定量比值法，參考實驗室公用PCR產物，對每一個樣本進行PCR擴增。

1.3 觀察指標

分析兩組G6PD缺乏癥患兒的靈敏度。

1.4 統計學方法

資料分析采用SPSS21.0統計軟件進行統計分析。定量數據用均數±標準差（）表示，組間比較采用Students t檢驗;所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，檢驗水準為0.05。

2 結果

實驗組G6PD缺乏癥患兒的靈敏度顯著高于對照組（P<0.05）

3 討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是一種遺傳性疾病，在服用蠶豆或多種氧化藥物后會誘發此病[2-3]。目前來看，尚未有根治葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患兒方法。本文研究結果顯示實驗組G6PD缺乏癥患兒的靈敏度顯著高于對照組（P<0.05）。多色探針熒光PCR熔解曲線法在檢測過程中具有以下優點：其一，簡單快捷;其二，閉管操作且減少污染;其三，生成結果后能夠自動判讀，從而減少人為因素所致的判讀失誤情況;其四，成本低。多色探針熒光PCR熔解曲線法相比起 Sanger 測序方法無需大型且昂貴的設備儀器，因此成本低且極易大規模進行基因篩查。有學者應用多色探針熒光PCR熔解曲線法檢測地中海貧血，結果顯示靈敏度高，與此同時利用多色探針熒光PCR熔解曲線法檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患兒具有特異性強和靈敏度高等優勢，繼而用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患兒的臨床輔助診斷。

參考文獻

林芬，吳教仁，楊輝等.粵東潮州地區葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者G6PD基因的突變類型[J].中華醫學遺傳學雜志，2016，33（1）：26-29.

李雅丹，吳琳琳，夏敏等.新生兒高膽紅素血癥葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測及臨床意義[J].中國婦幼保健，2016，31（19）：3961-3963.

趙學峰，李毅堅，蔡甜等.佛山地區孕產婦 G6PD 基因缺陷調查及干預模式研究[J].檢驗醫學與臨床，2016，13（9）：1172-1173，1176.