不同脅迫條件下白花三葉草種子的萌發特性

劉 偉，常 征，黃 勇

（文山學院 環境與資源學院，云南 文山 663099）

白花三葉草（Trifolium repensL），又名白三葉草、荷蘭翹搖、菽草、白花苜蓿、白車軸草，為豆科三葉草屬多年生常綠草本植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶高海拔地區，在我國淮河以南和西南地區均有栽培。三葉草是優質牧草，莖葉細軟，葉量豐富，粗蛋白含量高，粗纖維含量低，既可放養牲畜，又可飼喂草食性魚類，具有良好的生態價值和經濟效益。根部分蘗能力及再生能力均強，可以和菌根真菌形成良好的共生關系[1]。因其植株低矮，適應性強，被廣泛用于機場、碼頭、高速公路、公園廣場、街頭綠地等場所，是優良的水土保持和城市園林綠化植物。種子的萌發狀況是植物生長的關鍵步驟，在我國土壤酸化、土壤鹽漬化和干旱地區，土壤pH值、鹽脅迫、干旱脅迫等都是影響種子萌發的重要因素；研究不同脅迫條件下白花三葉草種子的萌發特性，對在具有相關逆境因素的區域推廣利用該植物資源具有重要意義。我國對白花三葉草的研究較晚，從種子萌發、固土護坡效果、蟲害、抗脅迫能力等方面的研究都有報道。王華軍對三葉草的病蟲害防治提了詳細的具體措施[2]，高占軍等研究得到鹽脅迫對白三葉種子的發芽率、發芽勢產生顯著的影響；當NaCl濃度＜0.40%時白三葉幼苗和根的生長速度幾乎不受影響，≥0.40%時受到抑制；白三葉幼苗體內游離脯氨酸、MDA和可溶性糖含量與鹽度的上升呈正相關關系[3]，黃壽臣等[4]研究表明：AM真菌與白花三葉草形成共生關系后能夠顯著改善復合鹽堿脅迫下白花三葉草的生長狀況。安利佳在1992年研究了白花三葉草葉愈傷組織誘導和植株再生的方法和技術[5]；陳寶書對三葉草的起源、生物學特性、形態特征、栽培技術等做了比較深入的研究[6]；胡迪先對紅三葉和白三葉的營養成分進行了分析[7]。本研究以種子萌發中經常遇到的土壤酸堿度、鹽堿化和干旱脅迫3種條件下的萌發特性為切入點，通過試驗，得到白花三葉草在三種不同脅迫條件下的萌發特性，為白花三葉草在鹽堿化土壤或干旱條件下的推廣利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年10月底在文山學院草坪收集白花三葉草種子，曬干后選取健壯、子粒飽滿、完整的種子作為試驗材料。試驗前先用1%高錳酸鉀溶液表面滅菌 10 min，再用蒸餾水沖洗3～4次。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同pH值對種子萌發影響的研究方法

先配制1 mol/L HCl和l mol/L NaOH，將培養溶液pH值調節成6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共5個梯度。將種子置于墊有濾紙的培養皿中并貼上標簽，加入不同pH值溶液，處理后開始每天用膠頭滴管滴加相應的pH溶液，使濾紙保持濕潤，每2 d更換一次培養液和濾紙，每處理50粒種子，重復3次。將培養皿放在（25±1）℃、有自然光照的實驗室里萌發，每天記錄種子發芽數，以胚根露出種皮為萌發標準，觀察記錄后及時清除已萌發種子。

1.2.2 鹽脅迫對種子萌發影響的研究方法

分別設置濃度為50、100、150 mmol/L的NaCl溶液，以蒸餾水培養作對照（CK），培養和處理方法同pH值溶液。

1.2.3 干旱脅迫對種子萌發影響的研究方法

用PEG6000配制干旱脅迫溶液，分別設置5%、10%、15%、20%、25%共5個濃度梯度，各處理均在（25±1）℃、自然光照的條件下進行，每個處理設置3次重復，每次重復50粒種子，以蒸餾水培養作對照（CK），種子的數量、萌發標準、培養方法和記錄方法同上。

1.2.4 種子萌發指標的測定

發芽以胚根突破種皮，露白為發芽標志，每24 h定時記錄種子萌發數。

發芽率（%）=試驗時間內發芽種子總數/供試種子數×100%

發芽勢（%）=發芽達到高峰時的發芽數/供試種子總數×100%

本試驗發芽高峰期為發芽數最多的一天。

發芽指數（GI）＝ ∑（Gt/Dt），式中：Gt為 t時間內發芽數，Dt為發芽天數

平均發芽時間=∑（d）n/∑n，式中：d為開始試驗日算起的天數，n為相應各天正常發芽粒數。

1.3 統計與分析

所有測量數據用Excel2016和Spss16.0軟件進行處理，不同試驗因素進行單因素方差分析，同一因素不同水平進行LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同pH處理對白花三葉草種子萌發的影響

2.1.1 不同pH處理對白三葉草種子發芽率的影響

由表1可以看出，白三葉草種子在6.0和6.5時發芽率均達到92.67%，隨著pH值的上升，發芽率呈現先下降后升高的趨勢，發芽率都在86%以上。進行方差分析后顯示組內和組間的發芽率沒有顯著性差異，種子的發芽率與CK無顯著性差異，發芽率均可達到86.00%以上，說明白三葉草種子在萌發期對土壤酸堿性要求不嚴，都能正常萌發。

2.1.2 不同pH處理對白三葉草種子發芽勢的影響

表1顯示，pH為6.0時，種子的發芽勢達到最大值（36.00%），pH為6.0～7.0時發芽勢呈現先降低后升高的變化趨勢，且在pH為6.5、7.5、8.0時達到最小值31.33%。這說明在pH=6時，白三葉草的發芽速度和整齊度都達最高，種子發芽快、出苗整齊。對數據進行方差分析可知，發芽勢在組內和組間也沒有顯著性差異。

2.1.3 不同pH處理對白三葉草種子發芽指數的影響

由表1可看出，pH在6.0～7.0時，種子的發芽指數呈現逐漸下降的趨勢；pH在7.0～8.0時，發芽指數隨pH值升高呈先增加后降低的趨勢，在pH6.0時達到最大值21.52，證明白三葉草種子生活力最強。對數據進行方差分析，各處理之間的發芽指數存在顯著差異，之后進行多重比較，在pH7.0時發芽指數顯著低于pH8.0，極顯著低于pH6.0、6.5和7.5，說明在pH7.0的環境對白三葉草種子的活力具有明顯的抑制作用。以上結果表明萌發環境的酸堿度對白三葉草種子的活力具有明顯的影響。

2.1.4 不同pH處理對白三葉草種子平均發芽時間的影響

由表1可知，總體上看平均發芽時間變化趨勢不明顯，都在2.95～3.59 d范圍之內波動。在pH6.0時，平均發芽時間最短為2.95 d，說明種子在pH6.0時發芽速度快，發芽能力較好。

表1 不同pH處理對白花三葉草種子萌發的影響

2.2 不同NaCl濃度處理對白三葉草種子萌發的影響

2.2.1 不同NaCl處理對白三葉草種子發芽率的影響

由表2可知，不同鹽濃度脅迫下，白三葉草種子的萌發情況不同，表現為：隨著鹽濃度的增高，發芽率逐漸下降，清水處理萌發率為95.33%，100 mmol/L 處理萌發率僅為26.00%，差異極顯著。對數據進行多重比較顯示100 mmol/L及以上濃度的NaCl處理后的萌發率顯著低于50 mmol/L 處理，說明有鹽脅迫的環境能明顯降低白三葉草種子的發芽率，增加萌發環境的鹽濃度能抑制種子的萌發。但在NaCl濃度為50 mmol/L時仍有64.00%的發芽率，表明白三葉草種子在萌發期對較低濃度的鹽脅迫具有一定的耐受性。

2.2.2 不同NaCl處理對白三葉草種子發芽勢的影響

由表2可知，不同鹽濃度條件下白三葉草種子的發芽勢不同，發芽勢高低順序為CK＞50 mmol/L＞150 mmol/L＞100 mmol/L，表現為隨著鹽濃度的上升，發芽勢逐漸降低。方差分析顯示，各處理組存在顯著性差異，且均與對照組間存在極顯著性差異，表明鹽濃度對白三葉草種子的發芽速度和整齊度產生明顯的影響。

2.2.3 不同NaCl處理對白三葉草種子發芽指數的影響

不同鹽濃度條件下，白三葉草種子的發芽指數不同，發芽指數大小順序為CK＞50 mmol/L＞150 mmol/L＞100 mmol/L。150 mmol/L 與 100 mmol/L處理差異不明顯但顯著小于50 mmol/L處理，極顯著小于對照組，結果表明高鹽濃度對白三葉草種子的活力具有顯著的抑制作用。

2.2.4 不同NaCl處理對白三葉草種子平均發芽時間的影響

由表2可看出，隨著鹽濃度的升高，平均發芽時間呈現逐漸延長的趨勢，表明鹽脅迫延長白三葉草種子萌發的平均發芽時間，導致發芽速度變慢。

表2 不同NaCl濃度處理對白三葉草種子萌發的影響

2.3 不同PEG濃度處理對白三葉草種子萌發的影響

2.3.1 不同PEG濃度處理對白三葉草種子發芽率的影響

由表3可知，不同干旱脅迫條件下白三葉草種子的發芽率不同，表現為隨著干旱程度的增加，種子的發芽率逐漸下降，在PEG=5%時發芽率為72.67%，當PEG濃度提高到10%和15%時，種子發芽率顯著下降，分別為44.67%和34.67%。進行方差分析得到各PEG處理與對照組間存在極顯著性差異。表明PEG處理對白三葉草種子的發芽率具有明顯的影響。

2.3.2 不同PEG濃度處理對白三葉草種子發芽勢的影響

表3顯示，不同干旱脅迫條件下白三葉草種子的發芽勢不同，平均發芽勢順序為CK＞5%＞10%＞15%＞20%＞25%，表現為隨著干旱程度的增加，種子的發芽勢逐漸下降。進行方差分析和多重比較，PEG濃度10%與15%、15%與20%、20%與25%沒有明顯差異。PEG各濃度處理與對照組之間均存在極顯著性差異，表明PEG濃度對種子的發芽速度和整齊度產生了影響。

2.3.3 不同PEG濃度處理對白三葉草種子發芽指數的影響

不同干旱脅迫條件下白三葉草種子的發芽指數不同，發芽指數順序為CK＞5%＞10%＞15%＞20%＞25%，表現為隨著干旱程度的增加，種子的發芽指數逐漸下降。對數據進行方差分析可知，PEG濃度為15%、20%、25%與對照組間均存在極顯著性差異，表明高濃度的PEG對白三葉草種子的活力具有明顯的影響。

2.3.4 不同PEG濃度處理對白三葉草種子平均發芽時間的影響

由表3可知，在PEG濃度為10%時，平均發芽時間最短（3.76 d），當PEG濃度在10%～25%時，隨著PEG濃度升高，平均發芽時間呈現逐漸延長的趨勢。說明當PEG濃度大于10%以后，延長了種子的發芽時間，導致萌發能力下降。

表3 不同PEG濃度處理對白三葉草種子萌發的影響

3 結論與討論

3.1 結論

3.1.1 不同pH處理對白三葉草種子萌發的影響

在不同pH值處理下，白三葉草種子的發芽率、發芽勢、發芽指數在pH值為6.0時發芽率（92.67%）、發芽勢（36.00%）、發芽指數（21.52）均達到最高，表明白三葉草種子萌發的最佳pH值為6.0，此pH值條件下種子表現出最強的生活力、萌發起始早、發芽整齊，完成整個發芽過程所需時間最短。但是方差分析發現白三葉草種子在pH值為6.0～8.0條件下均能正常萌發，表明白三葉草種子可適應各種土壤類型。

3.1.2 不同濃度鹽脅迫對白三葉草種子萌發的影響

在不同NaCl濃度處理下，白三葉草種子的發芽率、發芽勢、發芽指數均與對照組間存在極顯著性差異。當鹽濃度為50 mmol/L時，白三葉草種子仍能保持60%以上的發芽率，說明白三葉草種子能耐受相當于50 mmol/L NaCl濃度的鹽脅迫，是一種較為耐鹽的植物。鹽濃度＞50 mmol/L時，白三葉草種子的萌發受到嚴重的影響，鹽分不僅延遲了種子萌發的起始時間，同時也延長了完成萌發所需的總時長。

3.1.3 不同程度干旱脅迫對白三葉草種子萌發的影響

在不同干旱脅迫條件下，白三葉草種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、平均發芽時間均呈現出隨著PEG濃度的增加而逐漸下降的趨勢，且與對照組存在顯著性差異，在PEG濃度為5%時，仍有60%以上的發芽率，表明白三葉草種子在發芽期對低程度的干旱具有一定的耐受性。

3.2 討論

發芽率說明種子的活性，主要是指胚的活性，發芽率高說明具有活性的種子數量多；發芽勢說明種子的發芽速度和發芽整齊度；發芽勢高，說明種子的整體活力強；發芽勢也是反映種子活力強弱的指標，發芽率相同時，發芽勢高，種子活力強；平均發芽時間反映種子活力強弱，平均發芽時間短，說明種子活力越強。

土壤環境的酸堿度、電導率和干旱程度是影響種子萌發的重要因素，也是種子萌發過程中最常遇到的逆境因子，因此在研究種子逆境適應性和對逆境的響應時，大部分學者都采用pH值、NaCl溶液模擬鹽脅迫和PEG模擬干旱脅迫來進行試驗。用培養皿濾紙法、水培法等方法是常用的研究不同pH溶液對種子萌發影響在方法，許多用此方法研究的結果都表明種子在微酸性條件下萌發較好，胚的活性高、發芽速度和發芽整齊度高，種子表現出較強的活力，而且萌發后的幼苗長勢好[8-10]。本實驗也得到了相似的結論，可能是南方物種長期適應弱酸性土壤的結果。

鹽脅迫抑制植物的生長發育，造成植物生理代謝紊亂，不同的生育期有不同的表現形式。鹽脅迫影響植物細胞的正常生長代謝過程，導致種子發芽率、發芽勢和發芽指數降低[11]。在植物生長的整個生育期中，種子萌發期和幼苗生長期是最重要的2個階段，其中種子萌發期是最敏感的時期，也是對鹽脅迫響應比較敏感的階段，決定著作物的生長以及產量。不同的研究者用海水、NaCl 溶液和其它鹽類模擬鹽脅迫條件下不同三葉草品種的種子萌發特性和幼苗的生長特性，幾乎都得到了相似的結果，認為鹽脅迫對三葉草種子萌發和幼苗生長有一定的抑制作用，且抑制程度隨著濃度的提高而增加[12-14]，與本研究結果一致。

水分是種子萌發需要的重要外部條件，是制約種子萌發特性的重要因素。黃文娟等[15]對紅果小檗種子的萌發特性進行研究，結果表明，PEG濃度達到10%時，仍有60%以上的萌發率，說明紅果小檗種子是一種較為耐旱的植物。本研究得到白花三葉草在PEG濃度為5%時，有60%以上的發芽率，說明白三葉草種子也有一定的耐旱性，但比紅果小檗的耐旱性低。