西洛他唑改善腦梗死急性期小鼠腦血流量作用機制研究

盧山 唐波 詹建偉 陳子晞 徐遠勝 王芳 吳錦鴻

西洛他唑（cilostazol，CLZ）是一種磷酸二酯酶Ⅲ抑制劑，可通過抑制血管內環磷酸腺苷水平，起到抗血小板聚集作用[1]。已有證據表明，CLZ 可通過抑制細胞凋亡來保護血管內皮細胞，激活動脈平滑肌中鈣離子通道來誘導血管舒張從而影響腦血流量[2-5]。另有文獻報道長期持續口服CLZ 可改善腦梗死急性期后缺血半暗帶區域的腦血流量[6-8]，但是CLZ 對于腦梗死急性期腦血流量改善效果及作用機制鮮有報道。本資料通過在日本學習期間進行了前期研究，即在構建小鼠腦梗死模型并使用CLZ 進行治療后觀測建模小鼠左側大腦關注區域（region of interest，ROI）及對側映射區域（以矢狀縫為中線分隔的對側鏡像區域）的腦血流量值并進行對比分析，評估CLZ對于急性腦梗死后梗死區域腦血流量的改善效果；回國后進一步檢測加入CLZ 培養的小鼠大腦由來血管內皮細胞的磷酸化內皮型一氧化氮合酶（phospho-endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）與內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）比值，評估CLZ是否具有促進eNOS 活化的效果。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 （1）實驗動物：8 周齡雄性Icr 小鼠12只，體重18.0～23.0（20.0±3.0）g，由日本Clea Japan Inc公司提供，置于日本兵庫醫科大學動物房飼養，12h 明暗周期循環，控制室溫為（21±2）℃。制備腦梗死模型后1 周內予以粉狀飼料飼養。本實驗取得日本兵庫醫科大學動物保護委員會批準。（2）實驗離體細胞培養：CRL-2299 系列小鼠大腦由來血管內皮細胞由美國ATCC 公司提供。（3）藥物：CLZ，產品批號：190106P，50mg/粒，由浙江大冢制藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 為保證腹腔注射給藥劑量的穩定性，將CLZ 粉碎后用羥乙基-β-環糊精（2-Hydroxypropylβ-cyclodextrin，HPβCD）制備成性質較穩定的懸濁液；為排除HPβCD 影響，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）作為溶劑制備PBS 懸濁液。

1.2.2 小鼠腦梗死模型建立、分組及給藥 12 只小鼠均使用3%異氟烷誘導全身麻醉及1.5%異氟烷維持麻醉，以右側臥位固定，暴露左側顳部，消毒后于左耳外耳道至左眼連線中點處剪開皮膚，鈍性分離靜脈、唾液腺及肌肉，并電凝阻斷手術視野內所見血管。分離相關組織至左側顴骨顴弓區，剪斷顴骨，繼續分離肌肉及相關組織至顱底，在嗅索區域使用骨鉆去除顱骨，分離已暴露的硬腦膜，充分暴露左側大腦中動脈，在近嗅索區使用雙極電凝器阻斷左側大腦中動脈，并用顯微剪剪斷已電凝阻斷部位的殘余血管以確保血管阻斷。于手術區域加入動物用抗生素，將之前鈍性分離的組織復位，縫合皮膚。術后將小鼠放入恒溫箱內觀察，待完全脫離麻醉狀態后繼續相關實驗。手術過程中將小鼠體溫控制于（37.0±0.2）℃。建模成功后，小鼠左側大腦即出現局限于大腦皮層的腦梗死病灶。建模手術完成后30min，待腦梗死區域范圍穩定后, 將其分為CLZ 組、PBS 組和HPβCD 組,每組4 只，分別腹腔注射50μl 的0.5%CLZ懸濁液，50μl PBS 及50μl HPβCD 溶液。

1.2.3 腦血流量測定及比較 本實驗所行小鼠腦血流量測定及比較均在日本兵庫醫科大學先端醫學研究所神經再生研究部門完成。使用日本Omegazone 公司OZ-2 的激光多普勒腦血流儀進行腦血流量測定[9]。以780nm 半導體激光光束測量左側ROI（簡稱為L）及對側映射區域（簡稱為R）的腦血流量，由儀器讀取數值。L 測量區域設定為前囟左側2mm 偏背側1mm 范圍，包括部分梗死區及部分缺血半暗帶區域。于0min 及用藥后10、20、30 及60min 測量腦梗死模型建立后及用藥后L 及R 區域腦血流量，并比較上述各時點L 區域與R 區域的比值（L/R 比值）。腦血流量圖像中暖色調區域表明腦血量增加值較高，冷色調區域表明腦血量增加值較低。

1.2.4 小鼠大腦由來血管內皮細包eNOS 含量測定 采用Western blot 檢測。將CLZ（10μg/L）和等量HPβCD、PBS 分別加入培養液中對小鼠大腦由來血管內皮細胞進行培養，6d 后用10% SDS 凝膠電泳分離。采用英國Abcam 公司的eNOS 抗體測定eNOS 總量（t-eNOS），采用美國Cell Signaling Technology 公司的p-eNOS 抗體測量p-eNOS 抗體濃度，β-actin 含量作為檢測樣本含量參照。使用image J 軟件，分析各組蛋白電泳條帶teNOS、p-eNOS 及β-actin 的灰度值，在β-actin 灰度值進行統一化后換算，計算p-eNOS 與t-eNOS 灰度值比值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0 統計軟件，符合正態分布的計量資料以比較，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.13 組小鼠不同時間點的腦血流量圖像比較 見圖1（插頁）。

由圖1A 可見，CLZ 組小鼠在注射藥物后半暗帶區域腦血流量較其他兩組小鼠有所增加，暖色調區域較其他兩組面積大。由圖1B 可見，ROI 區域腦血流量較對側映射區域明顯下降。

2.23 組小鼠不同時間點的L/R 比值比較 見表1。

由表1 可見，3 組小鼠在注射后10min 時L/R 比值，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。CLZ 組小鼠注射后20、30、60min 時的L/R 比值均高于PBS 組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。CLZ 組小鼠注射后20min、30min 時的L/R 比值高于HPβCD 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。CLZ 組小鼠注射后20、30 及60min 時的L/R 比值均高于注射前（0min），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表13 組小鼠不同時間點的L/R 比值比較

2.3 小鼠大腦由來血管內皮細胞的p-eNOS 及t-eNOS 含量比較 見圖2。

圖2 小鼠大腦由來血管內皮細胞p-eNOS 及t-eNOS 含量比較（a：3 組小鼠大腦由來血管內皮細胞的p-eNOS 及t-eNOS 電泳圖；b：3 組小鼠大腦由來血管內皮細胞p-eNOS 與t-eNOS 灰度值比值比較）

由圖2 可見，加入CLZ 培養6d 后的小鼠大腦由來血管內皮細胞內p-eNOS 與t-eNOS 比值（0.673±0.074）大于PBS 組（0.425±0.093）和HPβCD 組（0.438±0.062），差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

CLZ 已在臨床用于腦梗死二級預防[10]。CLZ 為非水溶性物質，本實驗選用腹腔注射法以保證給藥劑量恒定性，因此本研究使用將CLZ 納米顆粒加入HPβCD 中制備懸濁液[11]，并使用CLZ 懸濁液進行腹腔注射給藥。

本研究通過腦血流量測定發現，CLZ 組小鼠ROI區域及對側映射區域腦血流量比值在注射后20～30min 時較注射前有明顯增加，而CLZ 組、100μl CLZ、PBS 組及HPβCD 組相關腦血流量比值在注射后無明顯改變。ROI 為腦梗死模型建模側區域，其對側映射區域為建模小鼠無腦梗死發生大腦半球區域，L/R 比值增加可以認為是在CLZ 給藥后，ROI 腦血流量較對側映射區域腦血流量有更強的改善效果，因此可以認為在Icr 小鼠腦梗死急性期使用適量CLZ 進行治療，可顯著增加半暗帶區域腦血流量。這與既往相關研究報道CLZ 可改善機體組織缺血區域血流量[12-13]，減少缺血后的組織損傷結論相符[14-15]。

通過免疫印跡試驗檢測發現，在樣本量相同的情況下，添加CLZ 培養的小鼠大腦由來血管內皮細胞內的p-eNOS 與t-eNOS 比值表達較PBS 組、HPβCD 組有明顯增加。因此我們認為，CLZ 可能是通過調節腦梗死區域p-eNOS 活性，使腦梗死區域內一氧化氮濃度增加，促進局部血管擴張，最終達到改善腦梗死區域腦血流量的目的。這與相關報道的eNOS 具備促進組織產生一氧化氮達到血管擴張效果結論相符[7，14]。

本研究所選用的L-MCAO 模型為局部微創手術。具備制備簡便，術后小鼠死亡率極低，長期存活率高，腦梗死模型病灶范圍、體積占病變側大腦總體積比例恒定等特點[5，9，15]。

本研究認為，CLZ 可通過激活eNOS 有效活性成分途徑，達到改善腦梗死局部區域腦血流量效果，但尚未檢測ROI 區域微小血管是否有增生，且未對CLZ 是否具有促進小鼠大腦由來血管內皮細胞增殖能力進行評估。已有相關報道CLZ 可能通過上調血管緊張素Ⅱ及血管內皮生長因子等途徑促血管生成因子的表達進而促進缺血區域血管新生[16-18]，相較于阿司匹林有改善血管相關細胞功能減少腦出血的能力[19-20]。eNOS 也可能具備促進微血管新生[21]以及改善內源性神經細胞功能的作用[22]，后續也將對CLZ 是否具有促進小鼠大腦缺血區域血管新生能力以及改善大腦缺血區域內的血管內皮細胞、神經細胞活性能力繼續進行探討。

綜上所述，CLZ 在腦梗死急性期可以通過激活eNOS 活性成分途徑，起到改善腦梗死區域腦血流量效果,為腦梗死后缺血區域受損組織修復提供必要條件。