囊胚發(fā)育速度及質(zhì)量對凍融周期單囊胚選擇的影響

王雪，肖亞玲，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷

（中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心，北京 100730）

在輔助生殖中，為了提高妊娠率往往會增加移植的胚胎數(shù)，但伴隨而來的就是多胎妊娠的問題。多胎妊娠對母親和新生兒的影響較大，如妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率、剖宮產(chǎn)率、早產(chǎn)率、小于胎齡兒發(fā)生率都顯著高于單胎妊娠［1］。近年來隨著輔助生殖技術(shù)（ART）的提高，妊娠率已經(jīng)得到極大改善。所以現(xiàn)在很多中心開始降低移植的胚胎數(shù)，甚至單囊胚移植（Single embryo transfer，SET）［2－3］。相對于卵裂胚而言，囊胚培養(yǎng)有很多優(yōu)點，囊胚在體外發(fā)育過程中跨越了8細胞階段的發(fā)育阻滯，經(jīng)過了一個再篩選的過程，從而囊胚移植后的種植率更高，有研究證實移植新鮮囊胚的妊娠結(jié)局優(yōu)于卵裂期胚胎［4］。因此SET是降低多胎妊娠率的有效途徑，而且有研究發(fā)現(xiàn)SET不會降低妊娠率和活產(chǎn)率［5－6］。因此如何挑選一個高發(fā)育潛能的囊胚對我們是一個極大的挑戰(zhàn)。目前多數(shù)中心仍然采用形態(tài)學評分的方法來挑選需要移植的囊胚，然而胚胎從卵裂期發(fā)育至囊胚階段的時間不一致，有的在獲卵后第5天行成囊胚，有的要到第6天甚至第7天行成囊胚［7］。囊胚發(fā)育速度是否對妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響產(chǎn)生較大的爭議。在新鮮周期的研究中，D5囊胚的妊娠率要優(yōu)于D6囊胚，但是不清楚是囊胚發(fā)育速度還是胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜容受不同步造成的［8－10］。因此，凍融周期能夠保證內(nèi)膜發(fā)育的一致性，能更好地分析囊胚發(fā)育速度對妊娠結(jié)局的影響。然而在復(fù)蘇過程中我們會遇到一些比較困惑的問題，如我們是優(yōu)選D5的囊胚還是D6的囊胚？對于D5的非優(yōu)質(zhì)囊胚和D6的優(yōu)質(zhì)囊胚，又該如何選擇呢？因此本研究的目的是聯(lián)合囊胚發(fā)育速度和囊胚質(zhì)量分析其對妊娠結(jié)局和新生兒出生結(jié)局的影響，為SET的囊胚選擇提供證據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選取2011年7月至2018年6月在北京協(xié)和醫(yī)院生殖中心進行單囊胚凍融移植的患者，對其資料進行回顧性分析。本研究納入的單囊胚復(fù)蘇移植的周期數(shù)為736個，按照囊胚行成的時間分為兩組：第一組為D5組，即在受精第5天行成囊胚；第二組為D6組，即在受精后第6天行成囊胚。再根據(jù)各組內(nèi)囊胚是否為優(yōu)質(zhì)胚胎，分為4組，分別為D5優(yōu)胚組（4～6BB以上者）、D5非優(yōu)胚組（4～6BC）、D6優(yōu)胚組（4～6BB以上者）和D6非優(yōu)胚組（4～6BC）。

二、研究方法

1．囊胚培養(yǎng)及囊胚評分：按照本中心的常規(guī)［11］進行操作，在受精后第3天進行移植，移植后的剩余胚胎全部進行囊胚培養(yǎng)。在D5或D6觀察是否有囊胚形成，并對囊胚形態(tài)進行形態(tài)學評分。囊胚評分根據(jù)Gardner評分系統(tǒng)［12］進行。根據(jù)囊腔的擴張程度分為1～6期，其中4期囊胚為囊腔完全擴張，透明帶變薄；5期囊胚為部分滋養(yǎng)細胞孵化至透明帶外；6期囊胚為完全脫出透明帶。根據(jù)內(nèi)細胞團（ICM）和滋養(yǎng)層細胞（TE）的質(zhì)量進行分級。ICM分級：A級（細胞數(shù)目多，排列緊密）；B級（細胞數(shù)目較少，排列松散）；C級（細胞數(shù)目很少）。TE分級：A級（細胞數(shù)目多，囊腔四周均有細胞排列緊密）；B級（細胞數(shù)較少，排列較松）；C級（細胞數(shù)目很少）。

根據(jù)本中心的既往經(jīng)驗，我們只挑選4期及以上的囊胚進行冷凍保存，達到冷凍標準的胚胎為：ICM質(zhì)量為A或B級，TE為A、B或C均可。根據(jù)本中心操作常規(guī)，我們定義ICM和TE質(zhì)量均在B級以上者（即AA、AB、BA和BB）為優(yōu)質(zhì)胚胎，BC級胚胎為非優(yōu)質(zhì)胚胎。

2．胚胎冷凍和復(fù)蘇：本中心全部采用玻璃化冷凍方法進行胚胎冷凍，如文獻所述［13］。先用激光進行人工皺縮，待囊腔液全部放出后再進行冷凍，冷凍時先在預(yù)平衡液中平衡2min，再轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液中，在30秒內(nèi)將胚胎放置冷凍載桿（Cryotop，加藤，日本）上，直接浸入液氮保存。囊胚復(fù)蘇在復(fù)蘇移植當天上午進行，復(fù)蘇后的囊胚進行激光輔助孵化，選擇在遠離ICM的透明帶上切割透明帶的1／4左右。將復(fù)蘇后的囊胚移入前一天預(yù)平衡好的培養(yǎng)液（G2，Vitrolife，瑞典）中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h，移植前根據(jù)囊胚腔是否重新擴張來判斷胚胎的存活情況。

3．子宮內(nèi)膜準備及胚胎移植：采用人工或自然周期進行子宮內(nèi)膜準備。移植后采用黃體酮進行黃體支持，移植后8～10d抽血測HCG判斷是否妊娠，移植后25～30d進行陰道超聲檢查，如見胎囊或胎心搏動則判斷為臨床妊娠。

4．結(jié)果判斷：臨床妊娠率＝臨床妊娠總例數(shù)／復(fù)蘇移植周期總例數(shù)×100%；活產(chǎn)率＝隨訪獲得活產(chǎn)的總例數(shù)／復(fù)蘇移植周期總例數(shù)×100%；流產(chǎn)率＝在妊娠過程中流產(chǎn)的例數(shù)／臨床妊娠總例數(shù)×100%；正常出生體重是指出生體重在2 500～4 000g之間者；低出生體重兒（LBW）是指出生體重＜2 500g者；巨大兒是指出生體重≥4 000g者。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22．0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間均數(shù)的比較進行t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用方差分析，對計量資料進行卡方檢驗或Fish精確檢驗。以P＜0．05判斷為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、總體情況

共納入736個復(fù)蘇周期，復(fù)蘇后囊腔均有擴張，囊胚存活率100%。患者平均復(fù)蘇年齡為（35．1±4．4）歲。臨床妊娠率為40．9%（301／736），流產(chǎn)率為19．6%（59／301），活產(chǎn)率為26．0%（191／736）。

二、囊胚發(fā)育速度對妊娠和出生結(jié)局的影響

D5組和D6組間年齡、不育年限，體重指數(shù)（BMI）、移植日內(nèi)膜厚度均無顯著差異（P＞0．05）。D5組中移植優(yōu)質(zhì)胚胎的比例顯著高于D6組（60．4%vs．36．6%，P＜0．05）（表1）。

D5組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均高于D6組，且有統(tǒng)計學差異（P＜0．05），兩組的流產(chǎn)率無顯著差異（P＞0．05）。盡管D5組的男女性別比高于D6組，但無顯著差異（P＞0．05）。兩組的新生兒出生身長和出生體重均無顯著差異（P＞0．05）。D5組巨大兒的發(fā)生率略高于D6組，但無顯著差異（P＞0．05）（表2）。兩組新生兒均未發(fā)生出生死亡和先天異常。

表1 D5組與D6組的一般情況比較［（），%］

表1 D5組與D6組的一般情況比較［（），%］

注：與D6組比較，＊P＜0．05

組 別 周期數(shù) 年齡 不育年限 BMI（kg／m2） 移植日內(nèi)膜厚度（mm） 優(yōu)質(zhì)胚胎占比D5 301 34．8±4．3 6．0±3．3 21．9±5．3 10．1±1．6 60．4（182／301）＊D6 435 35．0±4．7 5．7±3．7 22．1±4．8 9．9±1．7 36．6（159／435）

表2 D5組與D6組的臨床結(jié)局和新生兒出生結(jié)局［（），%］

表2 D5組與D6組的臨床結(jié)局和新生兒出生結(jié)局［（），%］

注：與D6組比較，＊P＜0．05

組 別 周期數(shù) 臨床妊娠率 流產(chǎn)率 活產(chǎn)率 性別比（男／女）D5 301 51．5（155／301）＊ 18．7（29／155） 33．9（102／301）＊ 60／42 D6 435 33．6（146／435） 20．5（30／146） 20．6（89／435） 41／48組 別 周期數(shù) 出生體重（g） 出生身長（cm） LBW發(fā)生率 巨大兒發(fā)生率D5 301 3 372．9±570．5 49．5±4．1 5．9（6／102） 12．7（13／102）D6 435 3 309．7±498．8 49．9±1．7 5．6（5／89） 7．9（7／89）

三、囊胚發(fā)育速度與形態(tài)學評分對妊娠和出生結(jié)局的影響

綜合囊胚發(fā)育速度與形態(tài)學評分分組，4組間年齡、不育年限、BMI和移植日內(nèi)膜厚度均無顯著差異（P＞0．05）。D5優(yōu)胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率最高，D6非優(yōu)胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率最低。D5優(yōu)胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于其他各組（P＜0．05），D5非優(yōu)胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均略低于D6優(yōu)胚組，但均無顯著差異（P＞0．05）；D6非優(yōu)胚組的臨床妊娠率顯著低于D5非優(yōu)胚組（P＜0．05），但兩組的活產(chǎn)率無顯著差異（P＞0．05）。4組間的出生體重、身長和男女性別比均無顯著差異（P＞0．05）（表3）。

表3 各組間一般情況及臨床／出生結(jié)局比較［（），%］

表3 各組間一般情況及臨床／出生結(jié)局比較［（），%］

注：與其他各組比較，＊P＜0．05；與D6非優(yōu)胚組比較，＃P＜0．05

組 別 周期數(shù) 年齡 不育年限 BMI（kg／m2）移植日內(nèi)膜厚度（mm） 臨床妊娠率 流產(chǎn)率D5優(yōu)胚 182 34．9±4．2 6．4±3．6 21．6±5．0 10．0±1．5 60．4（110／182）＊ 17．3（19／110）D6優(yōu)胚 159 35．6±4．4 6．1±3．9 22．3±4．8 9．8±1．8 45．9（73／159）＃ 17．8（13／73）D5非優(yōu)胚 119 34．7±4．6 5．5±2．7 22．1±4．9 10．2±1．4 37．8（45／119）＃ 22．2（10／45）D6非優(yōu)胚 276 35．0±4．6 5．5±3．5 21．9±5．2 10．2±1．6 26．4（73／276） 23．2（17／73）組 別 周期數(shù) 活產(chǎn)率 性別比（男／女）巨大兒發(fā)生率D5優(yōu)胚 182 42．3（77／182）＊ 45／32 3 351．9±516．3 50．0±2．3 5．2（4／77） 10．4（8／77）D6優(yōu)胚 159 27．7（44／159）＃ 22／22 3 333．4±483．8 50．0±1．7 4．5（2／44） 4．5（2／44）D5非優(yōu)胚 119 21．0（25／119）＃ 15／10 3 437．4±721．0 49．4±2．9 8．0（2／25） 20．0（5／25）D6非優(yōu)胚 276 16．3（45／276） 19／26 3 286．4±517．4 49．8±2．1 6．7（3／45） 11．1（5／45）出生體重（g）出生身長（cm）LBW發(fā)生率

討 論

如今隨著ART的發(fā)展，SET已被國內(nèi)外的各大中心廣泛接受，SET成功率有賴于挑選一個高發(fā)育潛能的囊胚。本研究的目的是在單囊胚移植周期中探討囊胚發(fā)育速度和囊胚質(zhì)量對妊娠結(jié)局和出生結(jié)局的影響，進而探討如何聯(lián)合囊胚發(fā)育速度與胚胎評分來挑選單囊胚進行移植。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)D5囊胚組的臨床妊娠率顯著高于 D6囊胚組（51．5%vs．33．6%，P＜0．05），而且D5囊胚組的活產(chǎn)率也顯著高于D6囊胚組（33．9%vs．20．6%，P＜0．05），這與 Kaye等［14］的研究結(jié)論不一致，他們分析了468個SET周期的資料，發(fā)現(xiàn)D5和D6兩組囊胚的妊娠率、繼續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率并無統(tǒng)計學差異；而與Ferreux等［15］的研究結(jié)論一致，在他們的研究中D5囊胚組的活產(chǎn)率顯著高于D6囊胚組，而且根據(jù)囊胚的形態(tài)學進行分組后，兩者的差異仍然存在，認為在質(zhì)量相似的囊胚中，發(fā)育速度快的胚胎的結(jié)局優(yōu)于發(fā)育慢的胚胎。分析原因，我們發(fā)現(xiàn)本研究中D5囊胚組的優(yōu)質(zhì)胚胎的比例顯著高于D6組（60．4%vs．36．6%），因此認為這兩組的差異可能是樣本選擇偏倚造成的，這與Ferreux等［15］的研究結(jié)論相似，同樣他們研究中D5組優(yōu)質(zhì)胚胎的比例顯著高于D6組（82%vs．68%），作者也認為可能是選樣偏倚導(dǎo)致了D5組的結(jié)局優(yōu)于D6組。

為了避免移植胚胎質(zhì)量偏倚的影響，我們將D5胚胎分為D5優(yōu)質(zhì)胚胎組（4～6BB以上級別）和D5非優(yōu)質(zhì)胚胎組（4～6BC），將D6胚胎分為D6優(yōu)質(zhì)胚胎組（4～6BB以上級別）和D6非優(yōu)質(zhì)胚胎組（4～6BC），并進行兩兩比較。我們發(fā)現(xiàn)對于優(yōu)質(zhì)胚胎而言，D5優(yōu)質(zhì)胚胎組的結(jié)局最優(yōu)，其臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于D6優(yōu)質(zhì)胚胎組，也顯著高于其他非優(yōu)質(zhì)胚胎組，這與Tubbing等［16］的研究結(jié)論相似。但是與國內(nèi)一些研究結(jié)論［17－18］不一致，他們認為兩組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率沒有統(tǒng)計學差異。在本研究中，對于非優(yōu)質(zhì)胚胎而言，D5非優(yōu)質(zhì)胚胎組的臨床妊娠率顯著高于D6非優(yōu)質(zhì)胚胎組，但是其活產(chǎn)率并無顯著差異，盡管D5非優(yōu)質(zhì)胚胎組活產(chǎn)率略高。這與國內(nèi)研究的結(jié)論［17－18］也是不一致的，盡管張怡等［17］發(fā)現(xiàn)D5組的臨床妊娠率略高，但是未發(fā)現(xiàn)顯著差異。另外，我們特別對D5非優(yōu)質(zhì)胚胎和D6優(yōu)質(zhì)胚胎的臨床結(jié)局進行了分析，結(jié)果提示兩組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率相似，盡管D6優(yōu)質(zhì)胚胎組略高一些。這與呂興鈺等［18］的研究相似，但略有不同，他們的結(jié)果提示兩組間無統(tǒng)計學差異，但D5非優(yōu)質(zhì)囊胚的臨床妊娠率和活產(chǎn)率略高于D6囊胚組，這也可能是移植囊胚數(shù)的差異造成的。綜上分析，我們與其他研究的差異可能在于對優(yōu)質(zhì)囊胚的定義和選擇不同，而且我們對囊胚的挑選更加嚴格，通常ICM評為C時，我們會選擇丟棄，而一些中心則會冷凍保存。

也有研究認為兩組之間的差異是由于在發(fā)育遲緩的囊胚中非整倍體率和基因異常率較高造成的［19－21］。Minasi等［22］對 1 730 個囊胚的整倍體狀態(tài)和形態(tài)學以及形態(tài)動力學參數(shù)之間的可能相關(guān)性進行了研究，他們發(fā)現(xiàn)整倍體胚胎開始形成擴張期囊胚的時間更短，而且ICM和TE質(zhì)量更好，根據(jù)患者年齡分組后仍然是D5囊胚組染色體正常的比例更高。因此他們建議在不進行PGS的患者中，選擇D5囊胚移植時選中整倍體囊胚的幾率更大。與此相反，有研究認為兩組的整倍體率無統(tǒng)計學差異，認為非整倍體率與囊胚的發(fā)育速度無關(guān)［23－24］。最近Irani等［25］發(fā)現(xiàn)，在僅移植整倍體胚胎時D5囊胚組的種植率和活產(chǎn)率顯著優(yōu)于D6囊胚，認為囊胚發(fā)育速度影響胚胎種植潛能的原因并非整倍體率的差異，可能還存在一些其他的因素，包括胚胎代謝或表觀遺傳學方面的原因等。由于本研究未進行囊胚整倍體的檢測，因此我們尚不能確定D5與D6囊胚移植結(jié)局的差異是否是由于染色體異常造成的，還需要進一步研究。

在本研究中，我們還對新生兒出生結(jié)局進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D5和D6兩組患者的新生兒的出生體重、身長和性別比差異不大，盡管D5的男女性別比略高于D6組。兩組均未發(fā)生先天性畸形和新生兒死亡。當對D5優(yōu)質(zhì)胚胎組、D5非優(yōu)質(zhì)胚胎組、D6優(yōu)質(zhì)胚胎組和D6非優(yōu)質(zhì)胚胎組進行兩兩比較時，均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異，這與郭娜等［10］的研究結(jié)論相似，而與Ferreux等［15］的研究結(jié)論相反，他們發(fā)現(xiàn)D6囊胚組新生兒的出生體重顯著高于D5囊胚組，認為這可能是由于D6組孕周較長所致。另外我們發(fā)現(xiàn)D5組的男女性別比略高于D6組，這與國內(nèi)外的一些研究結(jié)論［10，15］相似。分析原因可能在于與女性胚胎相比，男性胚胎發(fā)育速度更快，能夠以更快的速度達到囊胚階段［26］，而且男性胚胎要比同期的女性胚胎的質(zhì)量更好［27］。我們在進行囊胚冷凍時，通常會優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)囊胚進行冷凍保存，在復(fù)蘇移植時也會優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)囊胚進行復(fù)蘇移植，因此，D5囊胚中男性比例會大一些。在本研究中，我們觀察到對于D5和D6的囊胚而言，優(yōu)質(zhì)胚胎的男女性別比均略高于非優(yōu)質(zhì)胚胎，D6非優(yōu)質(zhì)囊胚的男女性別比最低，甚至為女多于男，這與前面的解釋相吻合，但具體作用機制還不清楚，有待于進一步研究。

總之，對于尚未開展PGS／PGT的中心來講，囊胚的形態(tài)學評估仍然是SET中囊胚選擇的主要手段。本研究提示，在單囊胚的凍融周期中，D5囊胚組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于D6囊胚組，而且D5優(yōu)胚組的臨床結(jié)局最好，因此，建議在單囊胚的凍融周期移植時，優(yōu)先選擇D5的優(yōu)質(zhì)胚胎；而面臨D5非優(yōu)質(zhì)胚胎和D6優(yōu)質(zhì)胚胎時，兩者均可考慮，可以根據(jù)實驗室的實際情況進行選擇。