SERCA2a在心力衰竭中的研究進展

李紅艷, 趙思涵, 王世華, 李巖松

(西藏民族大學高原環境與疾病相關機理研究高校重點實驗室，陜西 咸陽 712082)

心力衰竭(heart failure，HF)簡稱心衰，是各種器質性心臟病發展的終末階段。目前由于人口老齡化和急性心臟病向慢性病的過渡，心衰發病率和經濟負擔呈上升趨勢。動物實驗發現，Ca2+穩態異常是心衰發生的普遍特征。肌質網鈣離子ATP酶(sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是影響Ca2+循環的關鍵酶。近年來，關于SERCA2a在心衰中的作用，及以SERCA2a為靶點的藥物治療、基因治療和臨床研究現狀等日益受到重視，本文將對這方面的研究進展作一簡要綜述。

1 SERCA2a結構和生物學功能

SERCA屬于PIIA-ATPase亞家族，是一種跨膜蛋白，由胞質頭、跨膜螺旋(含有2個Ca2+結合位點)和腔環3個區域構成，心臟中主要表達SERCA2a。SERCA2a有兩種構象狀態：E1(高Ca2+親和態)和E2(低Ca2+親和態)。興奮-收縮偶聯(excitation-contraction coupling，ECC)時，膜去極化誘導電壓門控Ca2+通道打開，胞內Ca2+濃度增加，激活雷諾定受體2(ryanodine receptor 2，RyR2)開放，觸發內質網(endoplasmic reticulum，ER)局部釋放Ca2+，導致心肌收縮[1]。在Ca2+誘導的鈣釋放過程中，胞質Ca2+濃度從0.1～0.2 mol·L-1增加到2.0～10.0 mol·L-1。此時，Ca2+與SERCA2a的E1態結合，激活SERCA2a，裂解ATP，生成E1-P復合物。SERCA2a磷酸化后變為E2態。細胞質Ca2+被SERCA2a泵回ER或被細胞膜鈉鈣交換器(sodium-calcium exchanger，NCX)泵出細胞外，引起肌肉松弛。一旦Ca2+進入ER，SERCA2a由構象E2轉化為 E1，繼續攝取胞質Ca2+。SERCA2a每水解一個ATP，將兩個Ca2+從細胞質泵回ER。

2 SERCA2a在心衰中的表達和調控

心衰時，SERCA2a活性或含量下降，使內質網攝取Ca2+減少，胞質中Ca2+濃度下降速度和幅度不足，延緩心肌舒張；內質網Ca2+儲存量減少，心肌收縮釋放Ca2+減少，心肌收縮功能下降。而SERCA2a活性或含量受內源性蛋白抑制劑、翻譯后修飾、激素、小RNA(miRNA)和轉錄因子等調控。

2.1 PLN/PLB和SLN對SERCA2a的調控受磷蛋白(phospholamban，PLN or PLB)和肌脂蛋白 (sarcolipin，SLN)是同源內質網膜固有蛋白，分別由52和31個氨基酸殘基組成。PLN主要在心肌中表達，SLN在骨骼肌中表達較多。在小鼠和人中，PLN心室比心房組織表達高。SLN在心房組織中表達高，心室只有少量表達。PLN通過降低SERCA2a對Ca2+的親和力抑制SERCA2a活性。當胞質Ca2+濃度較低時，PLN與SERCA2a相互作用，降低SERCA2a Ca2+的表觀親和力。而Ca2+濃度較高時，由于Ca2+/鈣調蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)的激活，使蘇氨酸-17 (thr17)磷酸化，緩解了PLN對SERCA2a的抑制作用。另外，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)磷酸化PLN絲氨酸-16(Ser16)，也可減輕對SERCA2a的抑制，有利于增加心肌舒張速度[2]。Glaves等[3-5]進一步研究了PLN和SERCA2a結構間的關系，為闡明二者在鈣轉運中的作用提供更多依據。

1994年，Kiss等提出PLN調節SERCA2a可能存在兩種方式：快速短效作用，即PLN磷酸化水平對SERCA2a活性的影響；緩慢長期作用，通過SERCA2a /PLN比率變化，控制SERCA2a表達。研究發現，SERCA2a/PLN與肌漿網Ca2+攝取以及心肌收縮力呈正相關。大鼠心衰時，PLN磷酸化，SERCA2a/PLN下降，PLN對SERCA2a抑制作用增強。而在小鼠心衰模型中發現，PKA磷酸化PLN(Ser16)介導PLN多泛素化降解，致使PLN表達下調，SERCA2a mRNA降低，而PLN mRNA無變化[6]。另外，在心衰發展不同時期，SERCA2a活性也不一樣：心衰早期，代償心肌肥厚階段，SERCA2a活性增加；失代償階段，SERCA2a活性明顯下降?？梢姡乃ブ蠵LN對SERCA2a活性的調節機制還有待深入研究，可能與心衰的類型和階段等因素有關。

SLN可能通過降低其與SERCA2a的表觀親和力抑制SERCA2a的活性。絲氨酸/蘇氨酸激酶-16 (serine/threonine kinase-16，STK16)磷酸化SLN蘇氨酸-5 (Thr-5)殘基，可促進SLN與SERCA2a解離，提高SERCA2a的活性。在PLN-/-小鼠模型中發現，在給予異丙腎上腺素后，可使SLN與SERCA2a 解離，增強SERCA2a活性，促進心肌收縮。二尖瓣關閉不全手術患者的左心室組織中，SLN mRNA和蛋白水平升高12～16倍。可見，SLN負調節SERCA2a活性影響心功能。但有關心衰中SLN對SERCA2a的直接調控還未見報道。

2.2 翻譯后修飾對SERCA2a的調控翻譯后修飾包括糖基化、乙酰化、硝化、泛素化和甲基化等，可以直接調節SERCA2a表達。O-連接的-N-乙酰葡糖胺糖基化修飾(O-linked N-acetylglucosaminylation，O-GlcNAcylation)可以修飾SERCA2a蛋白表達，影響Ca2+轉運。糖尿病中O-GlcNAcylation表達增加引起SERCA2a蛋白水平下降，導致Ca2+舒張延長。腺病毒(adenovirus, AV)過表達O-GlycNAcase可降低O-GlcNAcylation表達，使總PLN蛋白降低，但升高了PLN磷酸化水平。可見，O-GlcNAcylation通過直接影響SERCA2a或者PLN磷酸化調控SERCA2a表達。糖基化在心衰中的作用還有待研究。

SERCA2a泛素化主要通過1型小分子泛素樣修飾蛋白(small ubiquitin like modifier，SUMO1)結合在SERCA2a賴氨酸480和賴氨酸585殘基上完成。心衰時總SUMO1減少，SERCA2a泛素化水平降低。在壓力超負荷心臟組織中注射SUMO1可提高心功能及SERCA2a活性。但干擾SUMO1表達后，SERCA2a蛋白水平降低，加重了壓力超負荷導致的心功能惡化?？梢?，SERCA2a泛素化對心臟有保護作用。

衰竭心臟中SERCA2a乙?；缴?，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；?(NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1，SIRT1)可逆轉該過程。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是茶多酚中的活性成分，可提高SERCA2a乙酰化修飾，從而抑制壓力過負荷誘導的心衰[7]。另外，人心衰中SERCA2a硝化表達增加。已知在擴張性心肌病SERCA2a硝化水平升高約2倍；糖尿病大鼠心臟中SERCA2a的硝基酪氨酸水平翻倍。并進一步證實，SERCA2a硝化是通過多元醇通路引起的。

趙翠萍等[8]發現心梗后心衰大鼠SERCA2a甲基化水平升高，而甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-dC)可減輕心衰程度。TNF-α通過促使SERCA2a啟動子區甲基化抑制SERCA2a基因表達，致使SERCA2a mRNA及其蛋白表達下降，促進心衰。另外發現，肼屈嗪可誘導心肌細胞SERCA2a啟動子區去甲基化，而三氯乙烯可誘導SERCA2a啟動子區甲基化。因此，對SERCA2a的DNA甲基化進行干預有望成為治療心衰的一個新方向和新靶點。

2.3 激素對SERCA2a的調控在胰島素治療大鼠糖尿病中發現，早期SERCA2a/PLN比值升高，心肌舒張速度增快，并且可能是通過PI3-kinase-Akt-SERCA2a信號通路引起SERCA2a水平增高的。O-(3-哌啶子基-2-羥基丙基)-煙堿偕胺肟(O-[3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl]-nicotinic amidoxime，BGP-15)是一種新型的胰島素增敏劑，可通過影響SERCA2a/PLN通路，增強心肌舒張功能[9]。在心肌缺血/再灌注損傷中，胰島素以AKT依賴和SERCA2a介導的方式恢復心肌細胞收縮功能。甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)異常與心衰緊密相關，而TH是SERCA2a轉錄水平上的重要調控因子。心肌細胞中注射TH可使SERCA2a mRNA增高。甲狀腺功能亢進常引起SERCA2a mRNA和蛋白升高，PLN mRNA和蛋白降低。而甲狀腺功能減退中SERCA2a mRNA和蛋白減少，PLN mRNA和蛋白上升。同時，甲狀腺功能減退癥患者中，促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平升高。TSH通過與心肌細胞膜TSH受體結合，抑制PKA/PLN信號通路，抑制SERCA2a的活性和表達，從而導致心臟舒張和收縮功能障礙。脂聯素是一種脂肪細胞來源的肽激素，通過促進SERCA2a活性，起到保護心臟的作用。在心肌缺血-再灌注模型中，靜脈注射脂聯素可使SERCA2a活性恢復到基礎水平。在H9C2細胞中加脂聯素培養1h后，SERCA2a mRNA表達量增加。有關胰島素、TH、TSH和脂聯素在心衰中調控SERCA2a表達的具體機制還有待進一步研究。

2.4 轉錄因子對SERCA2a的調控研究發現，心肌SERCA2a mRNA的表達與線粒體轉錄因子A (mitochondrial transcription factor A，TFAM)和B2 (TFB2M)的表達顯著相關。TFAM和TFB2M分別通過與SERCA2a基因-122～-114和-122～-117啟動子區結合調控心臟SERCA2a轉錄。在新生大鼠心肌細胞中發現，過表達TFAM和TFB2M使SERCA2a轉錄活性提高2倍。在糖尿病心臟和心肌梗死后心衰中，TFAM表達下調。另外，SERCA2a基因近端(-284 bp～-80 bp)啟動子區有7個與轉錄因子SP1結合的位點。SP1蛋白在壓力誘導過載心臟中引起SERCA2a mRNA下降。而有關TFAM、TFB2M和SP1在心衰中的調控機制還不明確。

2.5 其它miRNAs是一類調節轉錄后基因表達和蛋白翻譯的小非編碼RNA分子。在SERCA2a的3’未翻譯區域有miRNA識別位點。心衰中通過腺病毒介導miRNA-25過表達，SERCA2a蛋白含量下降。而在野生型小鼠體內注射miRNA-25反義寡核苷酸，可增加SERCA2a蛋白表達。另外，miRNA-22-/-小鼠與野生型小鼠相比，延長細胞質Ca2+衰退，使ER Ca2+負荷降低。肽基脯氨酰順反異構酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase)家族中的Pin1是心肌肥厚發育和心肌祖細胞周期的重要調節因子。Pin1活性降低與SERCA2a和NCX1蛋白水平增加相關。在心肌細胞內，Pin1可能通過與SERCA2a和NCX1蛋白相互作用調控Ca2+循環[10]。Pin1在心衰中的作用還有待研究。另外，心衰中抑制CaMKIIA表達，降低了RyR2表達，而SERCA2a表達上調，從而提高心功能[11]。B型鈉尿肽(b-type natriuretic peptide，BNP)是一種由心室肌細胞分泌的能夠反映心臟功能的激素，目前被用做心衰的一個定量標志物。心衰中發現，BNP可能通過抑制SERCA2a基因轉錄而降低SERCA2a基因轉移的療效[12]。心臟收縮力調制術(cardiac contractility modulation，CCM)是通過在心室絕對不應期給予電流刺激實現心衰治療的一種新方法，旨在改善左室收縮功能。在兔主動脈縮窄性心衰模型中發現，CCM通過抑制miR-25表達，促使SERCA2A表達增加，從而改善左心室收縮功能[13]。由此可見，miRNA-25、Pin1、CaMKIIA、BNP和CCM等在以SERCA2a靶向治療心衰中可能都發揮著一定作用，具體機制還有待深入研究。

3 SERCA2a是治療心力衰竭的有效靶點

3.1 通過干預PLN表達或磷酸化間接調控SERCA2a表達已知，PLN有降低SERCA2a對Ca2+的親和力，從而抑制SERCA2a活性的作用。因此，降低PLN或增加PLN磷酸化可能成為增加SERCA2a活性治療心衰的有效方法。研究發現，刪除PLN基因可增強SERCA2a功能，避免大鼠發生心室衰竭；倉鼠心衰模型中用重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)介導人PLN (S16E)磷酸化突變體可增強內質網Ca2+攝取并恢復心臟功能；AV轉移PLN假磷酸化突變體(AdS16E)可逆轉羊心衰的發展。另外，PLN功能缺失突變體表現出與SERCA2a高親和力。PLN抑制劑PP1 (protein phosphatase 1)已被廣泛用于改善內質網Ca2+的攝取。在心衰豬冠狀動脈內通過腺相關病毒-9 (adeno-associated virus 9，AAV9)輸注I-1c(內源性PP1抑制劑)可減少心肌梗死疤痕大小。PP1抑制劑 Calyculin A也具有正性肌力作用，與其激活SERCA2a活性有關[14]。

3.2 藥物干預調控SERCA2a表達在心衰治療中，目前已出現了一系列通過調控SERCA2a表達、改善心肌收縮力的中藥和化學合成藥。中藥如芪參顆粒，通過上調SERCA2a表達和活性、降低RyR2過度磷酸化、抑制PKA表達、上調PP1轉錄等方式減輕心衰大鼠心室重構[15]；木犀草素是一種廣泛存在于中草藥中的黃酮類化合物，通過靶向SERCA2a 泛素化和PI3K/akt通路參與心衰調節[16]；益氣活血方藥以調節心衰大鼠肌組織中 SERCA2a和IP3R mRNA的表達，改善心臟功能[17]。另外，心痛方、氧化苦參堿、補陽還五湯、黃芪、黃芪多糖、丹酚酸B和丹參等在治療心衰中也都以直接或間接調控SERCA2a表達或活性的方式改善心功能。

化學合成藥如伊思托賽(istaroxime)，SERCA2a的激動劑，在心衰中主要通過將PLN從SERCA2a/PLN復合物中取代下來，解除PLN對SERCA2a的抑制作用，從而加速Ca2+循環；吡啶酮衍生物(pyridone derivative)作用方式與伊思托賽類似[18]；喹諾胺化合物CDN1163是SERCA2a的一種變構激活因子，可直接與SERCA2a結合，減輕內質網應激[19]。比索洛爾、2,5-二羥甲基-3,6-二甲基吡嗪(liguzinediol)、纈沙坦、辛伐他汀、美托洛爾和氯沙坦等藥物均是通過提高SERCA2a活性，在心衰治療中發揮正性肌力作用。

3.3 SERCA2a基因治療臨床現狀SERCA2a表達和活性下降是心衰的一個重要特征，因此，通過轉基因上調 SERCA2a表達或提高其活性成為治療心衰的一項策略。AV和AAV是心血管疾病中最常用的載體。雖然應用AV轉載SERCA2a在心衰治療中已經取得了一些成績，但是AV介導的轉基因表達有短暫性和高度免疫原性缺陷。因此，目前多采用AAV載體介導轉基因表達，其免疫原性低，轉染效率高，并且在以SERCA2a為靶點的動物心衰治療中取得了顯著療效。

在臨床上，2007年，由美國發起了第一期心衰轉基因治療，旨在評價AAV1-SERCA2a基因治療對晚期心衰患者的安全性及生物學療效，取得了較好效果。緊接著進行了二期臨床試驗。二期臨床中發現，只有一小部分人心肌細胞表達了AAV1-SERCA2a。同時，相當一部分人中存在中和抗體(neutralizing antibodies，NAbs)，從而抑制AAVs載體在心肌中的吸收效率。這可能是由于AAVs載體中可插入目的基因的容量相對較小。另外，盡管兩期研究中用于測定的單鏈DNA劑量是相同的，但一期臨床較二期中用的載體含有較多空病毒衣殼。有證據表明，空病毒衣殼可以降低病人血清中NAbs含量。另外，二期患者采用的是順行冠脈給藥，該給藥方法的缺點是載體容易進入血液循環，隨血液循環可被帶到其他器官，所以降低了靶器官的吸收效率[20]。因此，就目前轉導率低的問題，有科學家提出未來研究應專注于發展基因轉導技術，以改進基因傳遞方法，開發更有效的載體系統，并控制中和抗體的影響[21]。

4 總結與展望

綜上所述，SERCA2a表達或功能異常直接影響著細胞內Ca2+循環，進而影響心肌收縮活動，成為引發心衰的一個關鍵因素。通過干預PLN或SLN表達，影響SERCA2a翻譯后修飾、激素水平和相關轉錄因子表達，以及藥物和基因治療等方法增加SERCA2a含量或活性，即或提高SERCA2a/PLN比值的方法都將成為治療心衰的可行策略。而在以SERCA2a靶向基因治療中存在兩個問題有待解決：轉導效率低和NAbs的出現。希望隨著SERCA2a在心衰研究中的深入，有更多替代治療方法的出現，如使用誘導多能干細胞移植或獲得新生心肌細胞，這樣可能會使患者長期獲益。

(致謝：本文是在西藏民族大學高原環境與疾病相關機理研究高校重點實驗室完成的。)