人羊膜上皮細胞的分離、培養和鑒定

江蕾微，董 仙，葉 藤，劉 志，李遠英，陸洪光

（貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550001）

近年來隨著臨床醫療領域不斷進步，Apligraf VR、Dermagraft VR等各種組織工程皮膚均已在臨床創面修復工作中發揮著重要作用。現階段多以同種異體角質形成細胞作為組織工程皮膚種子細胞[1]，但諸多因素提示其應用效果欠佳，有研究認為羊膜上皮細胞(hAECs)作為種子細胞將有利于提高臨床組織工程皮膚應用價值。hAECs具有向三個胚層分化可塑性[2]、表達生長因子（EGF、KGF、HGF）、抗炎和抗菌的細胞因子等優勢，從而對促進創面愈合具有積極意義。hAECs相較于人類胚胎干細胞而言，由于前者未表達端粒酶，在對其移植時腫瘤形成風險較低[2]，hAECs具有較低的免疫源性因此提示在對其移植后免疫排斥發生率較低。此外由于羊膜屬于產后廢棄物，因此取材簡單、易得性較優、無倫理學爭議，利于臨床推廣。由上述可知，將hAECs應用于組織工程皮膚再生工作中具有重要的研究價值。基于此，本文將著重探討分離、培養、鑒定人羊膜上皮細胞的方法，以期為今后臨床開展相關工作提供有利參考依據，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM 培養基（低糖型）（Gibco，USA），EGF（PeproTech，USA），胎牛血清（Hyclone，USA），Oct-3/4抗體（SantaCruz，USA），SSEA-4抗體（SantaCruz，USA），超凈工作臺（蘇州凈化設備公司），CO2細胞培養箱（Thermo公司，3111型），倒置生物顯微鏡（OLYMPUS，CK40-F200），熒光顯微鏡及照相系統（Olympus 公司），臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，TDL-40B型）。

1.2 羊膜來源

羊膜組織來源于貴州醫科大學產科，由健康足月產婦剖宮產手術成功分娩新生兒后留存的新鮮胎盤，通過對胎盤羊膜組織機械剝離使其盡量保持完整。本次研究內容通過本院醫學倫理研究會審核批準，標本取材前均征得本人同意且簽署相關協議（即醫院倫理委員會擬定的知情同意協議）。

1.3 hAECs分離培養

羊膜上皮細胞(hAECs)提取方法為胰蛋白酶（低濃度）多步消化分離法,具體如下：①PBS對羊膜組織反復沖洗，之后剪為細碎小塊待用；②組織中加入EDTA溶液（內含0.05%胰蛋白酶）并置入37℃環境下行10 min消化；③將消化液舍棄（即分離雜細胞、細胞碎片），重復消化30～40 min（條件同上）；④過濾（200目不銹鋼網）收集單細胞懸液，將其加入培養基（內含10%FBS）終止消化；⑤再次過濾后重復消化1次（步驟同上）；⑥利用完全培養基（內含10 ng/ml EGF）對離心收集細胞培養，即放置于37℃、5%二氧化碳培養箱內；⑦首次換液為24 h，之后每間隔3 d換液1次（全量），10 d左右細胞可根據常規方法實現傳代培養。

1.4 統計學分析

本文中計量、計數資料分別予以“±s”、n（%）形式體現，利用SPSS 26軟件檢驗相關數據（方法t/2），以P＜0.05提示對比結果存統計學意義。

2 結 果

2.1 肉眼觀察

由健康足月產婦剖宮產手術成功分娩新生兒后留存的新鮮胎盤剝離出厚度0.02～0.05 mm、透明、有韌性的羊膜組織。（見圖1）。

2.2 hAECs、KCs形態特征（原代培養）

原代hAECs接種24 h后可見多數細胞貼壁，細胞剛貼壁時呈圓形、折光性強，之后其胞質逐漸展開且折光性下降。3～5 d細胞貼壁進入指數生長期，此時可見細胞數量顯著增加、形態呈扁平多角形、核/漿比率較小的胞核則表現為圓形或卵圓形，6～8 d可見單層、細胞融合成片且表現出鋪路石樣，將其于顯微鏡下倒置觀察可見最初接種表皮細胞中存在較多KCs、少量黑素細胞及成纖維細胞，利用差別胰酶對其處理留存較純凈KCs。差別胰酶處理后所得第2代KCs可見細胞融合、表現為典型上皮細胞鋪路石樣、呈克隆狀生長，單個細胞具有清晰輪廓、呈圓形或多角形、折光性強。

2.3 hAECs來源特征（原代培養）

原代培養所得hAECs上皮細胞標記物經CKpan染色結果呈陽性，胞漿染色表現為棕褐色，蘇木精襯染胞核表現為藍紫色，提示培養所得細胞具有上皮特征。右圖為KCs陽性對照組。hAECs CK18染色（簡單原始上皮標志物）呈陽性、胞漿染色呈棕褐色、蘇木精襯染胞核表現為藍紫色，已成熟表皮細胞KCs中可見CK18染色呈陰性。

3 討 論

實驗研究中發現，hAECs較易分離培養，hAECs經過胰酶消化之后，原代細胞內有羊膜間充質細胞混雜其中，經傳代培養后可實現逐漸純化，hAECs具有典型上皮樣形態（即鋪路石樣）。免疫組化可見hAECs廣譜角蛋白、CK18染色呈陽性，提示其存在具有上皮細胞特征及向上皮分化潛能。hAECs表達胚胎干細胞表面標記物（即SSEA-4、OCT-4）,二者表達主要位于細胞高密度區、小克隆區、球體結構區，因此較為稀疏的hAECs區域多無表達。上述結果與Miki,T.等人研究一致。羊膜屬于產后廢棄物從而取材簡單、無倫理學爭議，加之hAECs易于分離、體外大量擴增且具有干細胞的特性，因此提示其屬于較為理想的組織工程種子細胞之一。