C57BL6J小鼠肝癌發(fā)生過程中sonic Hedgehog信號通路對CD90分子表達(dá)的調(diào)控作用

張珍妮

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院，廣西 南寧 530100）

目前肝癌發(fā)病率和死亡率仍有升高趨勢，仍有大部分肝癌病人未能得到及時(shí)救治。研究表明，信號通路的激活與抑制，對腫瘤的生物行為有著重要影響[1]。近年來sonic Hedgehog信號通路以及CD90分子在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的初步研究探索表明sonic Hedgehog信號通路以及CD90分子各自在肝癌發(fā)生、發(fā)展中起到一定調(diào)控作用，但兩者是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚。本次研究通過CD90在C57BL6J小鼠肝癌發(fā)生過程中Shh阻斷組和未阻斷組的表達(dá)情況探討sonic Hedgehog信號通路對CD90分子的表達(dá)有無調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

TRIzol Reagent RNA提取試劑（杭州沃森生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海玉博生物技術(shù)有限公司），熒光定量PCR儀（MJR公司）。實(shí)驗(yàn)引物分析的基因序列來自于Genbank。蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及蛋白印記實(shí)驗(yàn)發(fā)光底物試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；CD90單克隆抗體、Smo兔抗鼠多克隆抗體（美國millipore公司），β-actin單克隆抗體（康成生物公司）；辣根過氧化酶標(biāo)志羊抗鼠IgM（北京博爾西公司）；環(huán)耙明（cyclopamine）（美國selleckchem）。

1.2 DEN/CCl4等聯(lián)合誘發(fā)C57BL/6J小鼠原發(fā)性肝癌

C57BL/6J雄性小鼠100只，以DEN/CCl4/Ethanol等聯(lián)合誘發(fā)小鼠肝癌。實(shí)驗(yàn)組（誘癌組）分為Shh阻斷組和未阻斷組，每小組隨機(jī)選取40只小鼠；對照組中20只小鼠以正常顆粒飼料喂養(yǎng)。為了觀察腫瘤形成不同階段的肝癌干細(xì)胞分子CD90的變化規(guī)律及Shh信號通路相關(guān)分子（Smo基因及其相關(guān)蛋白）對CD90表達(dá)水平的調(diào)控情況，每2周各小組分別處死4只老鼠，獲取組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測和分析，20周誘癌成功后處死全部小鼠。Shh信號通路阻斷分析：針對Shh通路中Smo基因的siRNA將其沉默，觀察對肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響。因此，在誘導(dǎo)化學(xué)性肝癌的第4周（此時(shí)腫瘤還未形成處于藥物性肝炎階段）阻斷，沉默Smo基因，從而阻斷Shh信號通路，并與未阻斷組進(jìn)行比較分析。

1.3 RT-PCR檢測CD90mRNA的表達(dá)

RT-PCR和熒光地量PCR分析：對不同誘癌時(shí)期小鼠肝臟生理和病理變化過程中，CD90及Shh信號通路相關(guān)分子mRNA進(jìn)行RT-PCR和Real time PCR實(shí)時(shí)定量分析。引物分析的基因序列來自于Genbank（見表1，表2）。用DNAStar Lasergene 7.1進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

表1 Real time PCR引物

表2 Sonic Hedgehog兩信號通路mRNA擴(kuò)增的引物 Smo基因mRNA的靶序列

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測CD90-mRNA的表達(dá)

使用熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為：95℃30S，95℃ 5s，60.4℃ 30S，70℃ 30S，共40個(gè)循環(huán)，全部反應(yīng)結(jié)束后，連接電腦可自動(dòng)分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換為相應(yīng)CT值，并記錄分析。

1.5 Western印跡法檢測CD90-mRNA的表達(dá)

CD90的表達(dá)可用蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，以β-actin為內(nèi)參，轉(zhuǎn)膜→封閉→一抗4℃培育過夜→二抗→TBST洗膜→按化學(xué)發(fā)光法試劑盒的說明書發(fā)光→壓片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)組間、及實(shí)驗(yàn)組和對照組間的兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。按α=0.05的水準(zhǔn)判斷是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

Real time PCR檢測結(jié)果提示：實(shí)驗(yàn)組中Shh阻斷組和未阻斷組CD90在不同時(shí)期肝癌組織及正常肝組織中的表達(dá)，誘癌第16及20周的小鼠肝癌組織中Shh阻斷組及未阻斷組的CD90 mRNA與對照組中CD90mRNA的表達(dá)水平相比明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Shh阻斷組中CD90 mRNA表達(dá)水平比未阻斷組的低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同誘癌小鼠肝組織中CD90 mRNA分別在實(shí)驗(yàn)組Shh阻斷組、未阻斷組及對應(yīng)對照組的表達(dá)水平（±s）

表3 不同誘癌小鼠肝組織中CD90 mRNA分別在實(shí)驗(yàn)組Shh阻斷組、未阻斷組及對應(yīng)對照組的表達(dá)水平（±s）

注：CD90mRNA在小鼠肝癌實(shí)驗(yàn)中Shh未阻斷組的表達(dá)水平明顯高于正常小鼠肝組織（▲P＜0.05）； CD90mRNA在小鼠肝癌實(shí)驗(yàn)中Shh阻斷組的表達(dá)水平明顯高于正常小鼠肝組織（▲▲P＜0.05）；CD90mRNA在小鼠肝癌實(shí)驗(yàn)中Shh未阻斷組的表達(dá)水平高于阻斷組小鼠肝組織（▲▲▲P＜0.05）

誘癌時(shí)間（周） 4 8 12 16 20 CD90 mRNA 實(shí)驗(yàn)組 Shh未阻斷組 1.618±0.228 1.791±0.648 2.022±0.609 4.082±0.567 13.572±5.188 Shh阻斷組 1.318±0.116 1.428±0.227 1.518±0.528 2.618±0.128 10.518±0.328對照組 0.758±0.206 0.773±0.133 1.006±0.103 2.041±0.264 1.957±0.138▲t值 4.618 3.846 4.582 5.363 7.355▲▲t值 4.673 3.786 4.789 5.052 6.869▲▲▲t值 3.965 3.876 4.056 4.908 5.906▲P值 0.000 0.001 0.002 0.000 0.000▲▲P值 0.001 0.001 0.002 0.000 0.001▲▲▲P值 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

圖1顯示，實(shí)驗(yàn)組Shh阻斷組第4周、第8周和第12周均未見CD90蛋白條帶，在實(shí)驗(yàn)組中Shh阻斷組中第16周時(shí)開始出現(xiàn)清晰的CD90蛋白條帶，至第20周表達(dá)更明顯。圖2顯示，對照組、實(shí)驗(yàn)組Shh阻斷組在第4周、第8周和第12周無CD90蛋白條帶出現(xiàn)，而實(shí)驗(yàn)組Shh未阻斷組中誘癌第16周、20周時(shí)表達(dá)顯著，比Shh阻斷組的表達(dá)明顯（圖1、圖2）。

3 討 論

有研究表明CD90在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)行為深受關(guān)注。Yang等[2]發(fā)現(xiàn)CD90表達(dá)與肝細(xì)胞株的成瘤能力有密切關(guān)系。肝癌在發(fā)生發(fā)展過程中，是一個(gè)多因素參與、多基因相互作用和多條細(xì)胞信號通路交叉調(diào)控的結(jié)果。目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的信號通路主要有Wnt/beta-Catenin、Notch和Sonic Hedgehog（SHH或Hh）信號通路。國內(nèi)外對這些通路與腫瘤發(fā)生的關(guān)系有詳盡報(bào)道[3]，但是大多數(shù)研究多集中在手術(shù)切除后的腫瘤組織學(xué)標(biāo)本方面和以培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞株作為研究對象，對直接從小鼠動(dòng)物模型入手進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察肝癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)和Sonic Hedgehog（SHH或Hh）信號通路調(diào)控作用的研究報(bào)道甚少。在肝癌早期發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中，我們既往建立了C57BL/6J小鼠原發(fā)性肝癌動(dòng)物模型[4]，近年來我們以此動(dòng)物模型為基礎(chǔ)也初步探索了肝癌多種干細(xì)胞標(biāo)志物、信號通路在腫瘤發(fā)生過程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志CD90在誘癌16周后開始表達(dá)，CD90表達(dá)隨著癌變程度的增加其表達(dá)更為顯著。由此說明，肝癌干細(xì)胞標(biāo)志在腫瘤發(fā)生的不同階段不僅出現(xiàn)表達(dá)量的差異，而且其基因及蛋白表達(dá)啟動(dòng)的時(shí)間也有差異，既往研究表明這些差異因不同信號通路的調(diào)控而不同。相關(guān)的調(diào)控機(jī)制需要更進(jìn)一步深入研究，CD90D表達(dá)與Shh信號通路有無關(guān)聯(lián)仍無相關(guān)深入研究。

因此本研究設(shè)計(jì)通過阻斷此信號通路，并與未阻斷通路誘癌組和正常組進(jìn)行比較，從而探討Shh信號通路對CD90陽性標(biāo)志物有無的調(diào)控作用。目前在體外實(shí)驗(yàn)研究中，沉默Shh通路的方法很多，其中使用環(huán)耙明阻斷Shh信號通路已被廣泛應(yīng)用[5]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD90在實(shí)驗(yàn)組中Shh阻斷組及未阻斷組、正常組織中的表達(dá)差異，CD90在Shh未阻斷組中表達(dá)較阻斷組中高，提示Shh信號通路對肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90有一定的調(diào)控作用，但可能的調(diào)控機(jī)制仍需更進(jìn)一步研究，為進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生機(jī)制及抗肝癌干細(xì)胞靶向藥物設(shè)計(jì)提供新的研究思路。