響應面法優化超聲波提取楠竹葉黃酮工藝

許子競，黃世斌，戴天倫，張 芳，張 雄

(1.貴州工程應用技術學院 天然產物協調創新中心，貴州 畢節 551700；2.貴州民族大學 化學工程學院 貴州特色資源實驗室，貴州 貴陽 550000)

楠竹(Phyllostachyspubescens)，又稱毛竹，屬多年生常綠植物，在我國栽培歷史悠久，主要分布在我國長江以南的丘陵和山麓地區及山村房前屋后。楠竹材質堅韌，富彈性，篾性優良，在傳統應用中，主要用于建筑、農用、家具制作、生活用品等。近年來，隨著制藥工業和食品加工技術的發展，科研工作人員對竹資源的應用，有了更深層次的研究和認識，研究表明，竹葉提取物含有黃酮、茶多酚、酚酸、多糖等活性成分[1-3]，進一步研究揭示，竹葉中總黃酮含量較高，為2%左右[4-5]。竹葉黃酮具有抗氧化、抗衰老、防輻射、抗癌變、增強免疫力、降血脂和膽固醇、抗動脈硬化以及抑菌等作用[6-8]。

從竹葉提取竹葉總黃酮，目前大多數企業科研單位仍然采用傳統技術——溶劑浸提和溶劑外循環技術提取，但這些提取工藝技術，存在對原料利用率低、過程操作單元多、能耗高、產品溶劑殘留嚴重等問題。此外，提取過程中產生大量的廢水和廢渣，不僅嚴重污染了環境，還妨礙了竹葉總黃酮的高效提取和產品開發應用。

近些年來，超聲波輔助提取技術在藥品和食品工業逐步興起，超聲波輔助提取高效和快速的新技術，解決了傳統提取耗時和環境污染的問題，并且由于超聲波提取技術具有成本低、自動化程度高、操作性強等特點，使其較傳統提取工藝優勢更為明顯。因此，本試驗利用單因素和響應面法相結合，采用超聲波輔助提取技術，對楠竹葉黃酮的提取工藝進行優化，旨在為更合理、高效地提取竹葉黃酮以及開發利用竹葉資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3年生楠竹葉，貴州赤水林業局；乙醇，三氯化鋁，硫酸亞鐵，水楊酸，過氧化氫，焦性沒食子酸，分析純，蘆丁，上海同田生物技術股份有限公司；蒸餾水，實驗室自制。

JA-1003B電子天平，上海越平科學儀器制造有限公司；旋轉蒸發儀，上海沃瓏儀器有限公司；真空冷凍干燥機，上海豫明儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；BK-600D超聲波清洗器，濟寧鑫興超聲電子設備。

1.2 試驗方法1.2.1 竹葉黃酮的提取工藝

將竹葉粉碎后，準確稱取100 g竹葉粉碎樣品，用功率600 W的超聲波提取器提取，按工藝要求，加入體積分數為80%的乙醇，設定工藝要求料液比、提取溫度和提取時間，批料提取3次，隨后將提取液濃縮進行冷凍干燥，得干燥試驗樣品，供檢測用[9-10]。

1.2.2 單因素試驗

分別考察料液比[1∶7，1∶9，1∶12，1∶15，1∶18，1∶21，1∶24，1∶27(g∶mL)]、提取時間(30，33，36，39，42，45，48，51 min)、提取溫度(50，55，60，65，70，75，80，85 ℃)對竹葉黃酮提取含量和提取率的影響。

1.2.3 響應面試驗

根據本文“1.2.2”中的試驗因素進行Box-Behnken試驗設計，以竹葉黃酮提取含量為響應值(Y)，以料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)為變量因素，進行響應面優化，試驗設計見表1。

表1 三因素和三水平試驗設計

根據響應面設計要求，分別對料液比、溫度和時間進行變換：設A=(Z1-19)/6，B=(Z2-76)/8，C=(Z3-42)/6，以A，B，C為變量因素，楠竹葉黃酮提取含量(Y)為響應值，通過Box-Behnken試驗設計方案進行試驗，試驗結果見表2，差異顯著性分析結果見表3。

1.2.4 楠竹葉黃酮含量測定

蘆丁標準曲線的制作，參照趙振[11]標準曲線制作方法：準確稱取蘆丁標準品5 mg，置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，配制成0.2 mg/mL濃度母液，從母液中分別移取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6 mL置于10 mL的容量瓶中，移取2 mL的0.1 mol/L三氯化鋁溶液加入上述各容量瓶中，加入甲醇定容，室溫下放置15 min，供測定吸光度用。

楠竹葉黃酮含量的計算：

(1)

式中，M.粗總黃酮含量(%)；V0.取樣后定容體積(mL)；V1.樣品溶解后定容體積(mL)；V2.移取樣品體積(mL)；A.測定的吸光度；m.稱取的樣品質量(g)。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

蘆丁波長掃描結果和蘆丁標準曲線見圖1和圖2，線性回歸方程為A=46.125C+0.064(R2=0.992 3)，說明線性關系良好。由圖3可見，當加入三氯化鋁后，蘆丁標準品發生了紅移現象，且加入三氯化鋁后吸收峰較為明顯，蘆丁在420 nm附近有強烈吸收。

圖1 蘆丁波長掃描圖

圖2 蘆丁標準曲線圖

圖3 三氯化鋁對照的紫外吸收圖

2.2 單因素試驗結果2.2.1 料液比對竹葉黃酮提取率的影響

單因素料液比試驗結果見圖4。固定提取溫度76 ℃，提取時間42 min，料液比(g∶mL)從1∶7 增到1∶19，黃酮提取率由2.02%提升到3.53%。此后，隨著料液比的增加，黃酮含量開始略有下降，可能是由于溶劑量增加，引起提取物濃度稀釋，給試驗檢測結果造成偏低影響。因此，選擇料液比1∶19較為適宜。

圖4 料液比對竹葉黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時間對竹葉黃酮提取率的影響

單因素提取時間試驗結果見圖5。固定提取溫度76 ℃，料液比1∶19 g/mL，提取時間從30 min增加到42 min，黃酮提取率從1.41%上升到3.51 %。此后，隨著提取時間的延長，黃酮含量略有下降，可能是由于其他雜物質提取的增多，引起黃酮含量下降。因此，42 min是最佳提取時間。

圖5 提取時間對竹葉黃酮提取率的影響

2.2.3 提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響

單因素提取溫度試驗結果見圖6。固定提取時間42 min，料液比1∶19 g/mL，溫度從60 ℃到76 ℃，黃酮含量從1.43%到3.50%。此后，隨著溫度的升高，黃酮含量略有下降，可能是隨著提取溫度的升高，水溶性雜質也增多，引起黃酮含量降低。因此，76 ℃是最佳提取溫度。

圖6 提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響

2.3 響應面優化竹葉多糖提取工藝2.3.1 響應面試驗結果

在本文“2.2”單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計方案進行試驗，以竹葉黃酮提取率為響應值，得到試驗結果如表2，并進行響應面與方差分析得表3。

表2 Box-Behnken設計方案與試驗結果

表3 回歸系數的顯著性分析

利用SAS軟件對各因素回歸擬合后，得到多糖提取率與料液比、提取溫度和提取時間的二次多項回歸方程：

Y1=3.537+0.076A+0.145B+0.033C-0.223A2-0.036AB-0.038AC-0.375B2-0.036BC-0.067C2。

對表3進行顯著性和方差分析，該回歸方程(F=30.78，P<0.01)極顯著：相關系數R2=0.982 3，說明模型能可信度在98.23%以上。失擬項(F=2.74，P=0.279>0.05)不顯著，說明該模型擬合情況較好，受其他因素影響較小。回歸方程中一次項對竹葉黃酮提取率A顯著(P<0.05)、B極顯著(P<0.01)，交互項AB、AC、BC不顯著(P>0.05)；二次項A2、B2對竹葉黃酮提取率影響極顯著(P<0.01)。從方差分析F值大小(FB>FA>FC)可知，因素影響的主次順序為提取時間>料液比>提取溫度，綜上分析，說明該響應面模型有效、可靠。

2.3.2 交互作用分析

分析響應面三因素交互作用，結果見圖7～9，可見響應面為開口向下的凸形曲面，說明響應值存在極高值。在圖7中，在料液比達一定值時，提取時間和提取溫度相互作用較強，在提取溫度76 ℃和提取時間42 min左右時，竹葉黃酮提取率存在極值點；在圖8中，在提取時間一定時，提取溫度和料液比相互作用較強，在料液比1∶19(g∶mL)和溫度76 ℃左右時，竹葉黃酮提取率存在極值點；在圖9中，在提取溫度一定時，料液比和提取時間相互作用較強，在提取時間32 min和料液比1∶19(g∶mL)左右時，相互作用較強，竹葉黃酮提取率存在極值點。

圖7 料液比(A)和提取溫度(B)相互作用的等高線圖

圖8 料液比(A)和提取時間(C)相互作用的等高線圖

圖9 提取溫度(B)和提取時間(C)相互作用的等高線圖

2.3.3 驗證試驗

根據真實試驗條件，修正工藝參數為料液比(g∶mL)1∶20，提取溫度77 ℃，提取時間43 min，進行平行試驗，竹葉黃酮的提取率為3.43%。

3 結論

利用響應面法提取3年生楠竹葉總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶19.85(g∶mL)，提取溫度77.43 ℃，提取時間 42.97 min，預測的最佳竹葉黃酮的提取率為3.54%；根據真實試驗條件，修正工藝參數為料液比：1∶20(g∶mL)，提取溫度77 ℃，提取時間43 min，進行3次平行試驗，竹葉黃酮的提取率為3.43%，與預測值相比，其相對誤差為3.11%，說明該響應面模擬模型可信度高，與真實試驗接近。該研究結果可為竹葉黃酮的提取及竹葉資源的開發利用提供理論依據。