PSMA-a10/TGX221納米膠粒對人前列腺癌細胞株的靶向性研究

劉厚先 姚立鋒 江文聰 張棟 胡嘉盛 蔣軍輝 程躍 嚴澤軍

腫瘤靶向性治療是當今醫學研究的熱點，其基本原理是通過載體使藥物選擇性地在腫瘤組織聚集，增加腫瘤組織中的藥物濃度，同時減少其在非靶向部位的聚集，降低藥物對非靶向部位的毒副反應。前列腺癌（prostatic cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，每年PCa的發病率占男性所有新發腫瘤的20%[1]。對于早期的局限性病變，可通過根治性前列腺切除術達到臨床治愈；但是對于中晚期PCa，手術治療后還要聯合放療、化療和內分泌治療等手段，但這些治療方法存在用藥順應性差、組織選擇性差、毒副反應大、耐藥性較高等一系列問題[2]。因此，亟需找到一種能特異性地抑制PCa生長和轉移且很少或幾乎無毒副反應的全新療法。筆者前期研究顯示，前列腺特異性膜抗原（PSMA）適配子a10（PSMA-a10）/磷脂酰肌醇 3- 激酶（PI3K）p110β抑制劑TGX-221納米膠粒具有良好的腫瘤靶向特異性和生物相容性[3-4]。因此，本文就該納米膠粒對PSMA陽性及陰性人PCa細胞株生物學特性的影響以及其對PCa細胞的靶向性及相應機制作進一步探討，為PCa靶向治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI1640（500 ml，180110A）、胰蛋白酶（100 g，170224）購自美國 Sigma公司；FBS（100 ml，180425）購自杭州四季青公司；細胞計數試劑盒[CCK-8，100 T（1 ml），20180315]、ECL 顯色試劑盒（100 ml，180322）購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室（3422，180120）購自美國 Coring公司；聚丙烯乙二醇（PPG，10 g，171027）、TGX-221（2 mg，170907）購自美國Cayman Chemical公司；蛋白質提取試劑盒（250 ml，180311）購自美國 Pierce公司；PI3K p110β 兔抗人多克隆抗體（50 μl，171124）購自美國Abcam公司；Bcl-2兔抗人多克隆抗體（0.2 ml，20171029）購自美國Santa Cruz公司；碘化丙啶（10 mg，20170831）、甲基噻唑（MTT）溶液（5 ml，20170805）、細胞凋亡檢查試劑盒（Annexin V/FITC，20 T，171014）、Bcl-2兔抗人多克隆抗體二抗（1 mg/100 mg，20170930）購自武漢谷肽生物公司；PSMA-a10/TGX-221納米膠粒由本課題組合成，合成方法參考文獻[3]。倒置相差顯微鏡（ckx41）購自日本Olympus公司；凝膠成像分析儀（Q550IW）購自德國LEICA公司；酶標儀（Multiskan FC）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細胞株及細胞培養 PSMA陽性的人PCa細胞株LNCaP購自美國典型菌種保藏中心，PSMA陰性的人PCa細胞株PC-3購自武漢大學典型培養物保藏中心。分別培養于含10%FBS+青霉素100 U/ml+鏈霉素100 mg/L的RPMI1640培養液中，細胞在相對濕度為95%、37℃、5% CO2的環境中單層生長，每3 d換液傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞抑制率檢測 采用CCK-8法。將LNCaP細胞、PC-3細胞分別按5×103個/孔接種至96孔板，培養24 h后棄培養基，分別加入不同濃度的PSMA-a10/TGX-221 納米膠粒（0、0.1、1.0、2.0、4.0、8.0 和 16.0 μM）和裸露 TGX221（0、0.1、1.0、2.0、4.0、8.0 和 16.0 μM），每孔加入100 μl，每種濃度各設置3個復孔，對照組加入等體積的PPG，分別干預24 h。每孔再加入10 μl的CCK-8溶液繼續培養1 h，用酶標儀檢測各組細胞在450 nm處的吸光度（A450），細胞抑制率=[1-實驗組A450/對照組A450]×100%，繪制細胞抑制率曲線，計算藥物半數抑制濃度（IC50），以 PSMA-a10/TGX221 IC50的1/2為最合適的干預濃度用于后續實驗。本實驗重復3次。

1.4 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。取對數生長期的LNCaP細胞、PC-3細胞，細胞密度均調整為1×108個/L，接種于6孔板，待細胞貼壁。2種細胞分別設置 3個藥物干預組（100 μl/孔），即 PSMA-a10/TGX221組、TGX221組、PPG組；LNCaP細胞中給藥濃度為1.5 μM，而PC-3細胞中給藥濃度為7.0 μM。收集懸浮細胞，4℃預冷的PBS漂洗2次，用預先稀釋好的結合緩沖液制成濃度為1×106個/ml的單細胞懸液，然后取 100 μl置于 5 ml流式管中，加入 Annexin V/FITC、10 mg/L碘化丙啶各5 μl，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應管中加入稀釋后的結合緩沖液400 μl，應用流式細胞術檢測1×104個細胞，再采用Cell Quest軟件分析各組細胞凋亡情況。本實驗重復3次。

1.5 細胞生長指數檢測 采用MTT法。取對數生長期的LNCaP細胞、PC-3細胞，胰蛋白酶消化，調整為濃度1×103個/ml的單細胞懸液，按 150 μl/孔接種至 96 孔培養板，在37℃、5% CO2孵箱中培養24 h，待細胞貼壁。藥物干預方式及分組同1.4所述。每天各組取3孔，采用MTT比色法進行檢測（參照波長630 nm、檢測波長570 nm），根據測定的吸光度（A）繪制細胞生長曲線。A值越小，表示細胞生長速度越慢。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell小室法。藥物干預方式及分組同1.4所述。2種細胞經藥物處理24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，計數并調整細胞濃度為2×105個/ml。然后以無血清RPMI 1640培養液稀釋Matrigel膠，并鋪到Transwell上室，37℃孵育5 h制作基底膜。上室加入各組細胞500 μl，下室加入含有5 g/ml纖維粘連蛋白的RPMI 1640培養基，37℃孵育24 h，棄上室液體，用棉簽擦盡上室上層未穿過Matrigel膠的細胞，加入95%甲醇固定30 min并風干，0.1%結晶紫37℃染色30 min。在100倍光鏡下隨機取5個視野計數并取均值，即腫瘤細胞侵襲數，侵襲數越大表示細胞侵襲能力越強。每個標本檢測3次。

1.7 PI3K p110β、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blot法。藥物干預方式及分組同1.4所述。2種細胞經藥物處理24 h后，使用M-PERTM哺乳動物蛋白提取試劑盒提取總蛋白，12 000 g離心15 min，將上清液轉管，置于-80℃凍存。8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為30 μg總蛋白。電泳完畢后，使用電轉移儀將樣品轉至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入PI3K p110β 抗體和 Bcl-2抗體（均為 1∶1 000）、β-actin抗體（1∶2 000）4 ℃過夜，第 2天用 TBST清洗 5 min×3次。洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（工作濃度 1∶1 000），室溫下作用2 h。再次清洗5 min×3次，洗膜，ECL顯影，凝膠成像系統分析條帶的灰度值。使用圖像分析儀測定各條帶的積分吸光度（IA），IA=平均吸光度×面積。

1.8 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料用±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PSMA-a10/TGX-221納米膠粒及TXG221的IC50比較 PSMA-a10/TGX221、TGX221作用于LNCaP細胞24 h 的 IC50分別為（3.1±0.7）、（4.9±1.1）μM，差異有統計學意義（P＜0.05），細胞抑制率曲線見圖1a；兩者作用于PC-3細胞的IC50均為（13.5±2.3）μM，差異無統計學意義（P＞0.05），細胞抑制率曲線見圖1b。以PSMA-a10/TGX221 IC50的1/2為最合適的干預濃度，后續實驗中LNCaP細胞的PSMA-a10/TGX221、TGX221給藥濃度均為 1.5 μM，PC-3 細胞的 PSMA-a10/TGX221、TGX221的給藥濃度均為7.0 μM。

圖1 不同濃度PSMA-a10/TGX221和TGX221作用于LNCaP、PC-3細胞24 h后的細胞抑制率曲線（a：LNCaP細胞；b：PC-3細胞；PSMA-a10為前列腺特異性膜抗原適配子a10）

2.2 不同藥物干預組細胞凋亡率比較 LNCaP細胞中，3組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯高于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組又明顯高于TGX221組（P＜0.05）；PC-3細胞中，3組細胞凋亡率比較，差異亦有統計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯高于PPG組（均P＜0.05），但PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。

2.3 不同藥物干預組細胞生長指數比較 LNCaP細胞中，常規培養第1～3天3組細胞生長指數比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；第4～7天TGX221組、PSMA-a10/TGX221組細胞生長指數均低于PPG組（均P＜0.05）；第 5～7天 PSMA-a10/TGX221組細胞生長指數明顯低于TGX221組（均P＜0.05）。PC-3細胞中，常規培養第1～4天3組細胞生長指數比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；第 5～7天 TGX221組、PSMA-a10/TGX221組細胞生長指數均低于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表1 不同藥物干預組細胞凋亡率比較（%）

2.4 不同藥物干預組細胞侵襲數比較 LNCaP細胞中，3組細胞侵襲數比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組又明顯低于TGX221組（P＜0.05）；PC-3細胞中，3組細胞侵襲數比較，差異亦有統計學意義（P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于 PPG組（均P＜0.05），但PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表3和圖2（插頁）。

圖2 不同藥物干預后LNCaP細胞、PC-3細胞的侵襲實驗結果（PPG為聚丙烯乙二醇，PSMA-a10為前列腺特異性膜抗原適配子a10；a：LNCaP 細胞；b：PC-3 細胞；×100）

2.5 不同藥物干預組PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較 LNCaP細胞中，3組PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于PPG組（均P＜0.05），而PSMA-a10/TGX221組又明顯低于TGX221組（均P＜0.05）；PC-3細胞中，3組 PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較，差異亦均有統計學意義（均P＜0.05），其中 TGX221組、PSMA-a10/TGX221組明顯低于PPG組（均P＜0.05），但PSMA-a10/TGX221組與TGX221組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表4和圖3。

3 討論

研究表明，PI3K的亞型p110β在PCa組織和細胞株中超高表達，在雄激素刺激的細胞增殖和雄激素受體介導的基因表達中發揮關鍵作用[4]。Bcl-2蛋白是一種“存活”蛋白，在細胞正常增殖的情況下，Bcl-2過度表達能抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，促進細胞生存，從而引起細胞異常積累，增加細胞其他基因突變機會或使突變基因在細胞內集聚，導致細胞惡性轉化。另一方面，Bcl-2通過抑制細胞凋亡，增加腫瘤細胞數，導致腫瘤的發生、發展[5]。Bcl-2在PCa中高表達，抑制Bcl-2的表達可以抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡，延緩腫瘤侵襲和轉移[6]。有研究證實，p110β和Bcl-2在腫瘤發生、發展過程中發揮協同作用，兩者的表達水平密切相關[7]。由于TGX221難溶于水，當靜脈注射時需要有機溶劑PPG，而PPG有明顯的心臟毒性，使TGX221在臨床上的應用受到了限制[8]。本課題組合成的納米膠粒載體能增加目標分子的水溶性，且不含潛在有害的表面活化劑及輔藥如二甲基亞砜、PPG等，在安全定向運輸抗癌藥方面具有較高的應用價值[9]。

表2 不同藥物干預組細胞生長指數比較

表3 不同藥物干預組細胞侵襲數比較（個）

表4 不同藥物干預組PI3K p110β、Bcl-2蛋白相對表達量比較

圖3 不同藥物干預后LNCaP細胞、PC-3細胞PI3K p110β及Bcl-2蛋白表達的電泳圖（PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶，PSMA-a10為前列腺特異性膜抗原適配子a10，PPG為聚丙烯乙二醇；a：LNCaP細胞；b：PC-3細胞）

PSMA是一種特異性地表達于前列腺上皮細胞表面（腦、唾液腺和小腸等組織中極少量表達）的抗原，且表達不受激素分泌的影響。在晚期PCa和轉移性PCa中，PSMA表達升高尤為明顯。目前PSMA已被用于分子顯像診斷、腫瘤疫苗開發和靶向藥物傳遞等PCa診斷和治療的靶點[10-12]。尤其是以PSMA為靶點、RNA合成的適配子的成功開發，使得PSMA的應用前景更加廣闊[13]。核酸配體或適體是一種RNA或DNA分子，此分子通過核酸堿基間的互補配對，折疊出序列特異性的獨特構象，然后通過表面電荷和構象特征與特定蛋白靶點結合。適配子是短的單鏈寡核苷酸，沒有免疫原性及毒性，一旦適配子序列確定，即能大批量合成，并可以整合到其他微粒上，使之具備靶向特異性的藥物傳遞特征[14]。PSMA-a10的氨基末端能進行化學鏈接，且不影響其活性。

本研究應用PSMA-a10/TGX221納米膠粒作用于PSMA陽性及陰性的人PCa細胞株（LNCaP細胞、PC-3細胞），并與TGX221、PPG干預結果進行比較，結果發現在PSMA陽性的LNCaP細胞株中，與TGX221相比，PSMA-a10/TGX221的IC50更低，誘導細胞凋亡的能力更強，同時也能更好地抑制癌細胞增殖和侵襲。然而，在PSMA陰性的PC-3細胞株中，雖然PSMA-a10/TGX221和TGX221都能抑制腫瘤細胞的不良生物學行為，但這種抑制效應差異不明顯。Western blot檢測結果顯示，與PPG組、TGX221組相比，PSMA-a10/TGX221組LNCaP細胞中p110β、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低；而在PC-3細胞中，與PPG組相比，PSMA-a10/TGX221組、TGX221組p110β、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，但PSMA-a10/TGX221組和TGX221組比較差異無統計學意義。因為TGX221是一種對p110β具有高度特異性的小分子抑制劑，所以細胞中p110β的表達水平可以間接反映TGX221在細胞中的濃度。以上結果提示PSMA-a10/TGX221只對PSMA陽性的PCa細胞具有靶向性。

綜上所述，PSMA-a10/TGX221納米膠粒對PSMA陽性的PCa細胞具有靶向特異性，可能通過抑制p110β的活性、降低Bcl-2表達來抑制癌細胞的不良生物學行為。