硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的CoMFA模型

唐自強，馮長君

1. 徐州工程學院材料與化學工程學院，徐州 221018 2. 徐州技師學院，徐州 221151

分子結構是決定物質理化性質及其在環境中遷移轉化行為和生態毒理學效應的內因，因此，結構與性質之間具有內在聯系，以數學方程形式予以表達，就形成定量結構-活性相關關系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)。經統計診斷為質量良好的QSAR模型，可為有機污染物環境毒性評估提供參考信息，以降低昂貴的測試費用和減少動物實驗[1-8]。

硝基芳烴類有機物結構穩定，種類繁多且復雜，難以降解，屬高毒污染物。因此，這類化合物一直備受關注，有些硝基芳烴已被美國環境保護局和中國生態環境保護部列入優先控制污染物黑名單。為預測硝基芳烴類化合物生物毒性，閆秀芬等[9]和顧云蘭等[10]采用量化方法研究硝基芳烴對梨形四膜蟲(Tetrahymenapyriformis)的急性毒性(以半數生長抑制濃度的負對數值(pIC50)表征)；何琴等[11]和堵錫華等[12]基于人工神經網絡方法給出45種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的良好QSAR模型；金飆等[13]以量化參數給出了36種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的人工神經網絡模型；Liao等[14]以三維全息原子相互作用矢量場的(three-dimensional holographic vector of atomic interaction field, 3D-HoVAIF)方法建立了上述45種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性的QSAR模型。這些研究多為QSAR的二維方法，且所用三維-定量構效關系(3D-QSAR)方法[15-17]中也沒有涉及使用最為廣泛的比較分子力場分析法(comparative molecular force field analysis, CoMFA)。因此，筆者以CoMFA方法建立了45種硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性pIC50值[14]的3D-QSAR模型，以揭示硝基芳烴分子周圍立體場和靜電場分布對其急性毒性的影響，探討其生物毒性作用的分子機理。

1 數據來源(Data source)

45種硝基芳烴對梨形四膜蟲的急性毒性，以IC50表示，文獻[14]給出其pIC50。硝基芳烴分子的具體結構及pIC50值如表1所示。

表1 硝基芳烴的分子結構與急性毒性pIC50值Table 1 The molecular structures and pIC50 value of acute toxicity of nitroaromatic compounds

2 建模方法(Modeling method)

使用Tripos公司最新版本Sybylx2.1.1分子模擬軟件完成45種硝基芳烴[14]對梨形四膜蟲的急性毒性的3D-QSAR分析及建立CoMFA模型。

2.1 化合物低能構象的確定及分子疊合

一般采用分子的最低能量構象代替其生物活性構象。首先使用Sybylx2.1.1軟件中的Sketch Molecule模塊構建45個硝基芳烴分子[14]的初始三維空間結構，然后通過Minimize模塊，選取Tripos力場，加Gasteiger-Huckel電荷。以此進行所有分子的分子力學優化，獲取相應最低能量構象，并以此構象作為分子疊合的生物活性構象。

將45個硝基芳烴分子按照從低至高排序，遵循5∶1原則選取分子2、7、12、17、22、27、32、37、42和45為測試集(test set)，其中，45號為模板分子；余下36個分子作為訓練集(training set)，亦含45號模板分子。在CoMFA研究中，所謂模板分子是指總體生物活性最強的分子。常用的是基于公共骨架的原子契合疊合方法，即保證所有分子取向的一致性，使分子間相互重疊時的均方根偏差最小。以對梨形四膜蟲的急性毒性pIC50值最大的2,3,4,5-四氯硝基苯分子中的公共骨架，運用Align Database模塊分別對訓練集和測試集中分子予以疊合。訓練集的疊合圖如圖1所示(測試集的疊合圖與圖1相同，故予以省略)，由圖1可知，公共骨架的原子契合非常密切，呈現良好的疊合效果。

2.2 CoMFA模型的建立

采用Tripos標準力場，對訓練集和測試集的疊合分子周圍每個網格點上的立體場(steric, St)和靜電場(electrostatic, El)的場能值進行計算，采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)方法進行建模[18-19]。第一步，用逐一剔除法(leave-one-out, LOO)予以交叉驗證，即以pIC50為因變量，場能值為自變量建模，得交叉驗證系數(Q2)和最佳主成分數(N)。以Q2衡量模型的穩健性與預測能力，Q2>0.5的模型，才具有95%的可信度[20]，所含機會相關的可能性<5%。模型中的化合物數(m)與變量數(即最佳主成分數)之比稱為樣變比(Sv)。只有滿足Sv≥5的模型，才可能具有統計學意義且或然性較低[21-22]。第二步，用非交叉驗證的回歸分析，得到非交叉驗證判定系數(R2)、估計標準誤差(SD)和統計方差比(F)。一般認為，判定系數(R2)>0.80的方程是合理的，具有良好的擬合能力[23]。最后采用View CoMFA模塊，以三維等勢圖直觀反映出立體場和靜電場對化合物pIC50的貢獻。

3 結果與討論(Results and discussion)

3.1 CoMFA的3D-QSAR模型

訓練集的CoMFA模型：交叉驗證部分中Q2=0.738>0.5，N=5，Sv=m/N=7.2>5，表明模型具有很好的預測能力和穩健性；非交叉驗證部分中R2=0.932>0.8，顯示急性毒性與場能之間具有良好相關性；在95%顯著性水平下，訓練集的CoMFA模型的F臨界值為F0.05(5,30)=2.53。而模型的F值為82.40，是其臨界值2.53的32倍之多，表明所建模型密切相關。該模型的SD為0.201，僅是最大差值(ΔS=pIC50 max-pIC50 min=2.74-0.14=2.60)的7.7%，<10%，說明不存在離異點[24]。利用訓練集的模型對測試集中分子的pIC50進行預測，以檢驗其預測能力。測試集的pIC50預測值如表1所示，與相應實驗值基本吻合，平均絕對誤差僅為0.28，表明模型確實具有較好的預測能力。

3.2 CoMFA等勢圖

圖2(a)為訓練集中以pIC50最高的分子45號為模板的CoMFA模型的三維立體作用分布圖，其中，綠色區域表示增大取代基體積有利于提高化合物的急性毒性，黃色區域為減小立體位阻有利于提高急性毒性。由立體場的空間分布可知，在硝基的2、3和6位的3個位置上引入體積較大基團，相應化合物的pIC50升高。例如，在硝基的2、3和6位的3個位置上，溴取代的化合物急性毒性pIC50值高于氯取代的。分子17號強于12號，26號強于16號，29號強于23號。尚需指出，圖2(a)中未出現黃色區域，這可能因為在苯環上的所有取代基的體積都比梨形四膜蟲體內靶標提供的空穴要小，不存在空間位阻。

圖1 訓練集的三維疊合圖Fig. 1 The three dimensional view of all the aligned molecules in training set

圖2 CoMFA模型的立體場(a)與靜電場(b)等勢圖注：CoMFA表示比較分子力場分析。Fig. 2 CoMFA contour maps for (a) steric field and (b) electrostatic fieldNote: CoMFA stands for comparative molecular force field analysis.

圖2(b)為45號分子周圍的靜電場分布圖，藍色區域為增大基團正電性有利于化合物活性的提高，紅色區域則表示引入帶負電荷的基團對活性有利。由靜電場的空間分布可知，僅有一塊藍色區域在硝基的2、3位，且覆蓋苯環2、3位上的碳原子；紅色區域較多，表現出硝基的2、3位之間以及較遠離3位的2個紅色區域對急性毒性影響較大。如在硝基的2、3位的2個位置上，氟(負電性最強的取代基)取代的化合物急性毒性pIC50值強于氯(負電性較弱)取代的。分子34號強于21號，37號強于32號。

訓練集模型的立體場和靜電場對pIC50值的貢獻率依次為39.0%和61.0%，表明靜電場強于立體場。其中，靜電場主要為電荷庫倫力、氫鍵和配位作用。苯環上連有負電基團(—F、—Cl)等，使苯環上正電荷量增加，易進攻梨形四膜蟲體內酶、蛋白質等生物大分子的重要功能基團(如帶有負電荷的巰基、羥基和氨基等),從而影響梨形四膜蟲的正常生理功能，導致生物中毒。另外，苯環上的負電基團可與靶標內金屬離子形成配位鍵。對于立體場，一般包含空間位阻和疏水作用。其中，取代基體積越大，相應分子疏水性越強，脂溶性越好，越易被細胞膜富集而產生生物毒性。顧云蘭等[10]以量化參數建立了化合物的三元數學模型，模型中的變量包括苯環上凈電荷增量(ΔQR)、分子體積(V)和最低空軌道能。顯然，本研究結果與之基本一致。

綜上所述，本研究結果表明：

(1)基于CoMFA方法研究硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性pIC50值的三維定量構效關系：N=5，Sv=7.2，Q2=0.738，R2=0.932，F=82.40，顯示良好的相關性、穩定性和預測能力。

(2)所建CoMFA模型的三維等勢圖較好地解釋了硝基芳烴對梨形四膜蟲急性毒性pIC50值的影響，主要表現在苯環的2、3-位上鍵合體積較大的負電基團(如—F、—Cl等)利于急性毒性的增強。